響應面法優化蘇氨酸鉻合成工藝

胡曉波，王光然，姜雯雯，龔 毅，謝明勇*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

響應面法優化蘇氨酸鉻合成工藝

胡曉波，王光然，姜雯雯，龔 毅，謝明勇*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

以蘇氨酸和氯化鉻為原料，在水溶液中反應合成了新型鉻營養強化劑——蘇氨酸鉻。在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken試驗設計原理，選擇四因素三水平，利用響應面法優化蘇氨酸鉻的合成工藝條件，確定其最佳工藝條件為蘇氨酸與氯化鉻物質的量比3.86∶1、反應體系pH 6.11、反應溫度93.52 ℃、反應時間3.25 h，在此條件下蘇氨酸鉻產率為68.73%。實測值與回歸模型預測值（68.82%）相對誤差為0.13%，說明采用響應面法優化得到的合成條件可靠。

蘇氨酸鉻；合成；響應面法

鉻是人體必需的一種微量元素，參與機體糖、脂肪、蛋白質的代謝，與人體健康有著非常密切的關系[1]。如果人體缺鉻，將導致糖尿病和其他相關疾病[2-3]。補鉻對治療Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、妊娠糖尿病及類固醇引起的糖尿病等都有很好的療效[4-5]。Ravina等[6]的研究表明，鉻對Ⅰ型糖尿病以及類固醇引起的糖尿病均有很好療效；另有研究[7-8]發現，鉻能緩解Ⅱ型糖尿病患者的胰島素抵抗；Jovanovic等[9]則提出對于妊娠糖尿病婦女，補鉻可以作為一種輔助治療手段。鉻在降低畜禽應激、提高免疫力、改善繁殖性能、提高胴體品質、促進生長等方面均有作用[10-11]。

蘇氨酸鉻分子式為Cr(C4H8O3N)3，它是由3分子蘇氨酸與1分子鉻形成的螯合物[12-13]。前期實驗結果表明蘇氨酸鉻屬于實際無毒級別物質，具有一定的降低血糖的作用[14-15]。同時蘇氨酸鉻作為新飼料添加劑在動物養殖的實踐，表明其能有效促進動物生長、增強動物抵抗力，提高飼料利用效率[12]。因此，蘇氨酸鉻作為一種新型的營養強化劑將具有廣闊的應用與開發前景。

響應面法是一種多元分析方法，已經廣泛應用于食品、化工等領域的工藝條件優化研究[16-20]，本實驗采用蘇氨酸和氯化鉻為原料合成蘇氨酸鉻，通過響應面法[21]多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數關系研究各影響因素之間的交互作用，考察蘇氨酸鉻合成最佳反應條件，為營養強化劑蘇氨酸鉻的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鉻、氫氧化鈉 天津大茂化學試劑廠；L-蘇氨酸 上海勁馬生物科技有限公司。試劑除特別注明外均為分析純。

1.2 儀器與設備

Milli-Q超純水處理系統 美國Millipore公司；HH-4型恒溫水浴鍋、JJ-1型精密增力電動攪拌器 常州國華電器有限公司；DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；DZG-6050型真空干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；FiveEasy 20型精密pH計（帶Inlab Routine Pro電極） 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 蘇氨酸鉻的制備[12-13]

蘇氨酸和氯化鉻按適當比例溶解于超純水中，在一定溫度的水浴中加熱攪拌反應。反應過程中用NaOH溶液調節反應液到相應的pH值后，再反應相應的時間。反應結束后，將反應液置于室溫條件下冷卻結晶后抽濾，濾餅用大量超純水反復洗滌，抽干后，放入真空干燥箱中，于55 ℃、—0.95 MPa條件下干燥至質量恒定，稱質量后粉碎得到產品。

1.3.2 蘇氨酸鉻合成的單因素試驗

根據文獻[22-23]報道，反應體系pH值、蘇氨酸與氯化鉻物質的量比、反應溫度以及反應時間都可能會對蘇氨酸鉻產率（以其實際產量與理論產量之比計算）產生影響。因此，進行單因素試驗，考察這幾個因素對蘇氨酸鉻產率的影響。在固定蘇氨酸與氯化鉻物質的量比3∶1、反應溫度70 ℃、反應時間1 h條件下，反應體系pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；在固定反應體系pH 6.0、反應溫度70 ℃、反應時間1 h條件下，蘇氨酸與氯化鉻物質的量比分別為1∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1；在固定反應體系pH 6.0、蘇氨酸與氯化鉻物質的量比3.5∶1、反應時間1 h條件下，反應溫度分別為50、60、70、80、90、100 ℃；在固定反應體系pH 6.0、蘇氨酸與氯化鉻物質的量比3.5∶1、反應溫度90 ℃條件下，反應時間分別為0.5、1、2、3、4、5 h。

1.3.3 響應面法優化蘇氨酸鉻合成工藝條件

為了分析各因素之間的交互作用對結果的影響，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計，以蘇氨酸鉻產率（Y）為考察指標，分別以反應體系pH值、蘇氨酸與氯化鉻物質的量比、反應溫度以及反應時間對應4 個獨立變量X1、X2、X3和X4[24]，確定最佳的合成工藝條件，試驗的因素水平編碼見表1。

表 1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 反應體系pH值對蘇氨酸鉻產率的影響

圖 1 反應體系pH值對蘇氨酸鉻產率的影響Fig.1 Effect of pH on the yield of chromium threoninate

圖1 表明，反應體系pH值對蘇氨酸鉻產率有極大的影響。pH值較低時，蘇氨酸質子化，難以和鉻離子發生螯合反應生成蘇氨酸鉻，因此pH值小于4時，不能生成蘇氨酸鉻；當調整反應體系pH值為5.0～7.0時，蘇氨酸呈兩性離子形式，通過加堿中和蘇氨酸上的酸質子，有利螯合反應進行，反應過程中有桃紅色沉淀（蘇氨酸鉻）生成，在pH 6.0左右時，蘇氨酸鉻產率最高；而當反應體系pH值大于7時，溶液中OH—更易于與鉻離子發生反應生成帶有灰綠色的Cr(OH)3沉淀[23]。所以蘇氨酸鉻產率又呈現下降的趨勢。因此將反應體系pH值的考察范圍定為5.0～7.0。

2.1.2 蘇氨酸與氯化鉻物質的量比對蘇氨酸鉻產率的影響

圖 2 蘇氨酸與氯化鉻物質的量比對蘇氨酸鉻產率的影響Fig.2 Effect of molar ratio between threonine and chromium chloride on the yield of chromium threoninate

由圖2可知，在蘇氨酸與氯化鉻物質的量比2∶1～3.5∶1范圍內，隨著蘇氨酸物質的量比的增加，蘇氨酸鉻產率不斷增加，這是由于鉻離子的配體數隨著物質的量比的增加而增加，當蘇氨酸過量時可使反應進行得更加完全，產率得以提高，但當物質的量比達到3.5∶1后，產率提高緩慢。綜合考慮反應產率及經濟因素，蘇氨酸與氯化鉻的最佳物質的量比為3.5∶1。因此，響應面試驗中蘇氨酸與氯化鉻物質的量比考察范圍定為3∶1～4∶1。

2.1.3 反應溫度對蘇氨酸鉻產率的影響

圖 3 反應溫度對蘇氨酸鉻產率的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the yield of chromium threoninate

從圖3可以看出，隨著反應溫度的升高，蘇氨酸鉻產率不斷增加，高于90 ℃后，產率變化不大，因此將反應溫度的考察范圍定為80～100 ℃。

2.1.4 反應時間對蘇氨酸鉻產率的影響

圖 4 反應時間對蘇氨酸鉻產率的影響Fig.4 Effect of reaction time on the yield of chromium threoninate

圖4 表明，隨著反應時間的延長，蘇氨酸鉻產率不斷增加，當反應時間達到3 h后，產率增加緩慢，所以將反應時間的考察范圍定為2～4 h。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 回歸模型的建立及數據分析結果

采用四因素三水平的Box-Behnken試驗設計，綜合單因素試驗結果，確定最終試驗方案，共27 個試驗點。其中試驗號1～24為析因試驗，試驗號25～27為中心試驗，這27 個試驗點可分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構成的三維頂點；零點為區域的中心點，零點試驗處理3 次，其他處理1 次[16]，將每次試驗所得的蘇氨酸鉻產率列于表2。

采用SAS V8.0軟件對表2中的試驗結果進行多元回歸擬合，初步建立模型的二次多項回歸方程為：

采用SAS V8.0軟件的RSREG程序對表2中試驗結果進行響應面分析，經二次回歸擬合后，得到回歸方程方差分析見表3，可觀察模型各個變量之間的擬合程度。在回歸方程的一次項中，各因素對蘇氨酸鉻產率的影響程度從大到小依次為：X1、X2、X3和X4，其中X1、X2對蘇氨酸鉻產率影響達到極其顯著水平（P＜0.000 1），X3和X4對蘇氨酸鉻產率影響不顯著（P＞0.05）。在二次項中，因素X1達到極其顯著水平（P＜0.000 1），因素X2、X3達到高度顯著水平（P＜0.01），因素X4達到顯著水平（P＜0.05）。在交互項中，各因素之間的交互影響不顯著（P＞0.05）。

表 2 Box-Behnken試驗方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由回歸方程的顯著性分析可以得出總模型F=99.61，相應的概率值P＜0.000 1，該方程模型達到極其顯著。失擬項F=5.19，相應的概率值P=0.172 3＞0.05，失擬不顯著，結果證明該回歸方程無失擬因素存在，回歸模型與實測值能較好地擬合。此外，該模型的復相關系數R2為99.15%，校正后為98.15%，說明方程擬合較好，并且變異系數較低，為1.52，表明試驗的精確度較高，可靠性強。綜上所述，回歸方程給蘇氨酸鉻產率提供了一個非常合適的模型[24]。

表 3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression equation

2.2.2 交互影響因素顯著性分析

從響應面圖中可以更直觀看出各因素對響應值的影響，令其他因素水平值為零，僅考慮兩個因素對產率的影響，得到相應的響應面圖，如圖5所示。

圖 5 各因素交互作用的響應面圖Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of different parameters on the yield of chromium threoninate

從響應面圖來看，響應面開口向下，響應值隨著每個因素的增大而增大，當增大到極值點后，它又隨著因素的增大而逐漸減小。這個結果說明此模型有穩定點，且這個穩定點是最大值。對穩定點進行規范分析，結果見表4。

表 4 穩定點的規范分析Table 4 Canonical analysis of stationary point

2.2.3 回歸模型的驗證

采用表4中各因素的實際值進行3 次平行的驗證實驗，實驗結果蘇氨酸鉻產率為（68.73±0.10）%，與理論值的相對誤差為0.13%，實際產率與理論值非常接近，說明該方程與實際情況擬合很好。可以用該方程代替真實實驗點進行分析。

3 結 論

通過響應面法優化蘇氨酸鉻合成工藝為：反應體系pH 6.11、蘇氨酸與氯化鉻物質的量比3.86∶1、反應溫度93.52℃、反應時間3.25 h。在此條件下蘇氨酸鉻產率為68.73%。實測值與回歸模型預測值（68.82%）相對誤差為0.13%，說明采用響應面法優化得到的合成條件可靠。

在氨基酸微量元素的制備過程中，由于微量元素本身的特性及絡（螯）合反應的分步性和不完全性、生產工藝的原因，氨基酸微量元素產品的產率有時會偏低[25]，可以采取多次重復反應、生產過程中的結晶母液循環使用的措施，使反應完全，達到提高產率的目的[13,26]。

三價鉻是哺乳動物必需的微量元素之一，隨著吡啶酸鉻、芳香族有機酸鉻、脂肪族有機酸鉻、氨基酸鉻、酵母鉻等其他有機鉻螯合物多種具有生物活性的有機鉻產品相繼被研制開發，在醫藥、保健品和飼料添加劑等方面得到廣泛應用，新型高附加值、高生物活性和環境友好的有機鉻產品研發和應用顯得尤為迫切[27-28]。蘇氨酸鉻在補充鉻的同時，還兼具補充人體必需氨基酸的目的，它在動物養殖、調節血糖等方面已顯示優異的性能，因此，實驗通過探索蘇氨酸鉻的合成工藝，希望能為鉻營養強化劑的開發提供理論依據。

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Optimization of Synthesis of Chromium Threoninate by Response Surface Methodology

HU Xiaobo, WANG Guangran, JIANG Wenwen, GONG Yi, XIE Mingyong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Chromium threoninate is a new type of chromium supplement. It was prepared by adding chromium chloride to an aqueous solution of threonine. By combined use of single factor method and response surface methodology with a Box-Behnken design involving four factors with three levels, the optimal synthesis conditions were determined as reaction between threonine and chromium chloride with a molar ratio of 3.86:1 for 3.25 h at pH 6.11 and 93.52 ℃. Under these conditions, the actual yield of chromium threoninate was 68.73%, similar to the expected value (68.82%) with a relative error of 0.13%, suggesting the reliability of the optimized synthesis conditions.

chromium threoninate; synthesis; response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630（2015）02-0036-05

10.7506/spkx1002-6630-201502007

2014-06-30

江西省自然科學基金項目（20132BAB204002）；江西省重大科技創新研究項目（20124ACF00400）；

江西省教育廳產學研合作項目（GJJ11002）

胡曉波（1971—），女，副教授，博士，研究方向為食品化學與營養。E-mail：hxbxq2005@163.com

*通信作者：謝明勇（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品營養學、食品安全、功能保健食品。E-mail：myxie@ncu.edu.cn