莫諾苷對腦缺血再灌注大鼠皮層梗死周邊區基質金屬蛋白酶表達的影響①

侯虹麗，孫芳玲，艾厚喜，張麗，王文

莫諾苷對腦缺血再灌注大鼠皮層梗死周邊區基質金屬蛋白酶表達的影響①

侯虹麗1，孫芳玲2，艾厚喜2，張麗2，王文2

目的研究莫諾苷對大鼠腦缺血再灌注3 d皮層梗死周邊區基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表達的影響。方法健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠15只隨機分為假手術組(n=3)，模型組(n=3)，莫諾苷小劑量組(n=3)、中劑量組(n=3)及大劑量組(n= 3)。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)30 min再灌注模型。術后3 h，莫諾苷各組予莫諾苷30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg每天1次灌胃。術后3 d，免疫組化染色觀察腦缺血皮層梗死周邊區MMP-2、MMP-9表達。結果與假手術組比較，模型組皮層梗死周邊區MMP-2、MMP-9表達明顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，莫諾苷各組MMP-2、MMP-9表達明顯降低(P＜0.01)。結論莫諾苷能降低大鼠腦缺血再灌注3 d皮層梗死周邊區MMP-2、MMP-9的表達，從而保護血腦屏障功能。

腦缺血再灌注；莫諾苷；基質金屬蛋白酶-2；基質金屬蛋白酶-9；大鼠

[本文著錄格式]侯虹麗，孫芳玲，艾厚喜，等.莫諾苷對腦缺血再灌注大鼠皮層梗死周邊區基質金屬蛋白酶表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2015,21(1):5-8.

CITED AS:Hou HL,Sun FL,Ai HX,et al.Effects of morroniside on expression of matrix metalloproteinases in peri-infarct cortex after cerebral ischemia-reperfusion in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):5-8.

缺血性腦卒中是由于腦血管內發生血栓、栓塞或其他原因導致腦供血不足而引起的腦血管疾病[1-2]。腦卒中后急性期，除了細胞死亡外，另一個非常重要的損傷機制是神經血管單元損傷，這種損傷已被證明可破壞血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)的功能[3-4]。血腦屏障是由腦血管內皮細胞、基底膜和星形細胞等組成的復雜系統，是維持腦內微環境的重要結構，其通透性與中樞神經的損傷、炎癥等有密切關系[5]。腦缺血再灌注后血腦屏障的結構和功能遭到破壞[6]：結構破壞主要表現為包繞微血管的膠質細胞發生腫脹和退行性改變、毛細管內皮細胞特性改變等；功能改變主要表現為通透性改變。血腦屏障的通透性改變與缺血后再灌注的時間密切相關。缺血再灌注3 h，血腦屏障的通透性開始增加；再灌注24 h，血腦屏障通透性升至高峰，維持至48 h；再灌注72 h以后血腦屏障的通透性逐漸減小[7]。因此，在腦缺血再灌注損傷中，抓住血腦屏障的3 h治療窗，對腦卒中的治療意義深遠。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是分解細胞外基質的蛋白酶類中最重要的一類，在生

理和病理過程中均發揮重要作用。其中，MMP-2和MMP-9是MMPs家族中的重要成員，它們作為最重要的細胞外基質降解酶，與血腦屏障損傷關系最為密切[8]。目前研究認為，MMP-2的表達與腦缺血再灌注后早期血腦屏障的開放有關，而MMP-9與缺血再灌注后血腦屏障的第2次開放有關[9]。MMP-2、MMP-9激活后，參與降解血腦屏障基膜的主要成分，促使血腦屏障開放，破壞腦保護屏障，引起血腦屏障的通透性增加，造成進一步損傷[10]。

莫諾苷是我們從山茱萸中提取的環烯醚萜苷類重要單體成分。我們的前期研究除了驗證莫諾苷體外抗氧化和抗凋亡的功能外[11-12]，體內試驗表明，莫諾苷能減小局灶性腦缺血損傷模型大鼠的大腦梗死體積，促進神經功能的恢復[13]。本研究中我們對莫諾苷調節MMPs的活性，發揮神經保護作用進行研究，為腦卒中治療藥物的研發提供實驗證據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及給藥

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠15只，體重260～280 g，由北京維通利華實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(京)2006-0009。12 h晝夜循環清潔級飼養，預適應環境1周后進行實驗。將大鼠編號1～15，用隨機數字表法分為假手術組，模型組，莫諾苷小、中、大劑量組，共5組，每組3只。

莫諾苷由本實驗室從中藥山茱萸的干燥成熟果肉中提取。高效液相色譜儀對組分進行分析，純度98.5%。使用時將其溶于蒸餾水。術后3 h開始，莫諾苷小、中、大劑量組按30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg每天1次灌胃給藥。假手術組和模型組予等體積蒸餾水。

1.2 主要儀器和試劑

尼龍栓線，直徑0.26 mm(2634-100)：北京沙東生物技術有限公司。Thermo Scientific輪轉式切片機：上海萊卡儀器有限公司。Olympus BX51顯微鏡：日本OLYMPUS光學工業株式會社。MMP-2抗體：武漢博士德生物工程有限公司。MMP-9抗體：美國SANTA CRUZ公司。DAB顯色試劑盒：上海基因科技有限公司。

1.3 模型制備

參考Longa線栓法[14]制作大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。大鼠造模前一晚禁食，自由飲水。10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸部消毒，切開右側頸部，逐層分離暴露右側頸總動脈、頸外動脈以及頸內動脈，分別結扎右側頸總動脈及右側頸外動脈。在頸總動脈近動脈分叉處剪一小口，將線栓插入右側頸內動脈約18～20 mm，感到輕微阻力時立即停止插線。縫合傷口，抗生素預防感染，留置線頭于體外。30 min后拔出尼龍線。

假手術組麻醉后進行相同手術操作，但不插線。

術后控制室溫25～30℃，3 h后動物清醒，觀察其行為。依據Longa 5分法進行術后行為學評分：0分，正常，無神經功能缺損；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，行走時，向對側(癱瘓側)轉圈，中度神經功能缺損；3分，行走時，向對側(癱瘓側)傾倒，重度神經功能缺損；4分，不能自發行走，有意識喪失。評分1～3分為造模成功，0和4分淘汰。采用差額補充方法補足各組設計所需大鼠數量。

1.4 免疫組織化學染色

1.4.1 腦組織切片

術后3 d，所有大鼠10%水合氯醛20 ml/kg腹腔注射麻醉，固定四肢，快速剪開胸腔，剪開心包膜，暴露心臟和主動脈弓。用9號針頭插入左心室至主動脈，灌注生理鹽水；待右心耳流出液無色透明時，用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定，直至動物呈僵硬狀態。灌注0.5 h后開顱取腦，將腦組織浸于后固定液中過夜。腦組織冰凍切片，厚40 μm，取前囪前1.60 mm到后0.2 mm，10個切片，每個腦組織選3個切片。

1.4.2 染色

所選切片于新鮮配制的3%H2O2室溫孵育10 min；PBST洗3次，每次5 min；滴加5%～10%正常山羊或兔血清，室溫孵育30 min，傾去；滴加MMP-2、MMP-9一抗工作液(1∶200)，4℃過夜；PBST洗3次，每次5 min；滴加生物素標記抗兔或鼠二抗工作液，37℃搖床孵育10～30 min；PBST洗3次，每次5 min；滴加適量的辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～30 min；PBST洗3次，每次5 min；新鮮配制的DAB室溫顯色5～10 min；水洗，梯度乙醇脫水，卵白素-生物素過氧化物酶聯合3,3'-二氨基聯苯胺復染，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.4.3 圖像分析

光學顯微鏡觀察皮層梗死周邊區MMP-2、MMP-9陽性細胞。選擇梗死區邊緣皮層區域3個感興趣區域(400×300 μm)，用Image-pro Plus圖像分析系

統計數MMP-2、MMP-9免疫反應陽性細胞積分光密度(IOD)值。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 MMP-2

MMP-2免疫組化陽性細胞呈星形膠質細胞狀表達(圖1)。模型組MMP-2陽性細胞表達比假手術組顯著升高(P＜0.001)；莫諾苷各組MMP-2表達較模型組顯著降低(P＜0.001)。見表1。

2.2 MMP-9

MMP-9免疫組化陽性細胞呈神經元細胞狀表達(圖2)。模型組MMP-9陽性細胞表達比假手術組明顯升高(P＜0.01)；莫諾苷各組MMP-9表達較模型組明顯降低(P＜0.01)。見表1。

表1 各組術后3 d皮層梗死周邊區MMPs表達(IOD)

圖1 各組術后3 d皮層梗死周邊區MMP-2表達(免疫組化染色，40×)

圖2 各組術后3 d皮層梗死周邊區MMP-9表達(免疫組化染色，40×)

3 討論

腦卒中后MMPs對血腦屏障的損傷起著決定性作用[15]，MMPs與缺血性腦卒中的形成、發展以及預后的關系已成為近年來研究的熱點。在正常狀態下，MMPs的活性被控制在較低水平；但在生理及病理條件下，MMPs過度激活，使細胞外基質降解并且導致外周血管損傷[16]。MMP-2、MMP-9的激活促使血腦屏障開放，引起血腦屏障的通透性增加。

腦卒中患者和大鼠局灶性腦缺血模型中，MMPs表達都顯著增加[17]。周進研究顯示，MMP-2在缺血再灌注大鼠腦中表達上調，并與再灌注早期血腦屏障的開放及后期組織修復即血管生成有關[18]。Asahi等研究顯示，腦缺血模型MMP-9表達明顯增加；而敲除MMP-9基因能減輕腦梗死過程中的腦損傷，顯著減少腦梗死區面積，具有腦保護作用[19]。MMP-9在腦缺血發作24 h至數月內被激活，而MMP-2激活由于需要TLMP-2的參與，一般在腦缺血后2～5 d表達增加[15]。

本研究顯示，腦缺血再灌注損傷后3 d，缺血側皮層梗死周邊區MMP-2和MMP-9表達均上調，與已有報道一致[20-21]。表明MMPs在缺血性腦卒中發病早期參與到腦缺血損傷的病理機制中，并在時間順序上反映出MMPs的合成在神經細胞繼發性死亡中的重要

作用。給予莫諾苷治療后，MMP-2和MMP-9表達明顯降低。我們推測，莫諾苷在腦卒中后早期的神經保護作用機制之一可能是下調MMPs。

莫諾苷對MMPs的作用可能不同于MMPs抑制劑。嚙齒類腦缺血模型研究表明，由于MMPs與血管形成有關，因此MMPs抑制劑會阻斷或減慢腦卒中后神經修復，其保護作用在缺血后48 h失效[22]。

[1]Lo EH,Dalkara T,Moskowitz MA.Mechanisms,challenges and opportunities in stroke[J].Nat Rev Neurosci,2003,4(5): 399-415.

[2]Moskowitz MA,Lo EH,Iadecola C.The science of stroke: mechanisms in search of treatments[J].Neuron,2010,67(2): 181-198.

[3]Arai K,Lok J,Guo S,et al.Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke[J].J Child Neurol,2011, 26(9):1193-1198.

[4]Zlokovic BV.The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders[J].Neuron,2008,57(2):178-201.

[5]Marchi N,Fazio V,Cucullo L,et al.Serum transthyretin monomer as a possible marker of blood-to-CSF barrier disruption[J].J Neurosci,2003,23(5):1949-1955.

[6]鄒偉,孫曉偉,于學平,等.血腦屏障與腦缺血再灌注損傷研究進展[J].中華中醫藥學刊,2009,27(3):466-468.

[7]張宇玲,蔡文杰.腦缺血再灌注動物模型的血腦屏障損傷[J].中國組織工程研究,2012,16(15):2848-2850.

[8]Rosenberg GA.Matrix metalloproteinases and their multiple roles in neurodegenerative diseases[J].Lancet Neurol,2009,8 (2):205-216.

[9]吳旭東,曹小定.血腦屏障與腦缺血[J].國外醫學腦血管疾病分冊,2000,8(5):272-275.

[10]張毅,徐群,蘇敏,等.缺血性腦卒中患者急性期血漿中基質金屬蛋白酶-9含量的動態變化[J].腦與神經疾病雜志,2003,11 (4):226-227.

[11]Wang W,Huang W,Li L,et al.Morroniside prevents peroxide-induced apoptosis by induction of endogenous glutathione in human neuroblastoma cells[J].Cell Mol Neurobiol,2008,28 (2):293-305.

[12]Wang W,Sun F,An Y,et al.Morroniside protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity[J].Eur J Pharmacol,2009,613(1-3):19-23.

[13]Wang W,Xu J,Li L,et al.Neuroprotective effect of morroniside on focal cerebral ischemia in rats[J].Brain Res Bull, 2010,83(5):196-201.

[14]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats[J].Stroke, 1989,20(1):84-91.

[15]Gasche Y,Copin JC,Sugawara T,et al.Matrix metalloproteinase inhibition prevents oxidative stress-associated blood-brain barrier disruption after transient focal cerebral ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,2001,21(12):1393-1400.

[16]張法永,陳銜城,任惠民,等.缺血預處理對腦缺血血腦屏障通透性和MMP-9表達的影響[J].復旦學報(醫學科學版),2001, 28(3):216-219.

[17]Rosell A,Ortega-Aznar A,Alvarez-Sabín J,et al.Increased brain expression of matrix metalloproteinase-9 after ischemic and hemorrhagic human stroke[J].Stroke,2006,37(6): 1399-1406.

[18]周進.MMP-2及MMP-9在缺血再灌注大鼠腦中的表達及意義[J].遼寧醫學雜志,2005,19(4):175-176.

[19]Asahi M,Wang X,Mori T,et al.Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock out on proteolysis of blood-brain barrier and white matter components after cerebral ischemia[J].J Neurosci,2001,21(19):7724-7732.

[20]Yang Y,Thompson JF,Taheri S,et al.Early inhibition of MMP activity in ischemic rat brain promotes expression of tight junction proteins and angiogenesis during recovery[J].J Cereb Blood Flow Metab,2013,33(7):1104-1114.

[21]Rosenberg GA,Cunningham LA,Wallace J,et al.Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases in reperfusion injury to rat brain:activation of MMP-9 linked to stromelysin-1 and microglia in cell cultures[J].Brain Res,2001,893(1-2): 104-112.

[22]Nag S,Manias JL,Stewart DJ.Pathology and new players in the pathogenesis of brain edema[J].Acta Neuropathol,2009, 118(2):197-217.

Effects of Morroniside on Expression of Matrix Metalloproteinases in Peri-infarct Cortex after Cerebral Ischemia-reperfusion in Rats

HOU Hong-li,SUN Fang-ling,AI Hou-xi,ZHANG Li,WANG Wen.Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China

Objective To study the effects of morroniside on the expression of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 in the peri-infarct cortex 3 days after cerebral ischemia-reperfusion.Methods 15 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=3),ischemia group(n=3),and morroniside groups(low,medium and high dosage groups,n=3).The middle cerebral artery were occluded for 30 min,and re-perfused.Morroniside was administered intragastrically once a day at dose of 30 mg/kg,90 mg/kg and 270 mg/kg 3 hours after operation.The expression of MMP-2 and MMP-9 in peri-infarct cortex were detected with immunohistochemistry staining 3 days after operation.Results The expression of MMP-2 and MMP-9 increased in the ischemia group compared with the sham group(P＜0.01),and it decreased in all the morroniside groups compared with the ischemia group(P＜0.01).Conclusion Morroniside could decrease the expression of MMP-2 and MMP-9 in the peri-infarct cortex 3 days after ischemia,suggesting protecting the function of blood-brain barrier from ischemia.

cerebral ischemia-reperfusion;morroniside;matrix metalloproteinase-2;matrix metalloproteinase-9;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.002

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0005-04

2014-09-09

2014-09-24)

1.“重大新藥創制”科技重大專項(No.2012ZX09102201-016)；2.國家自然科學基金項目(No.81173575；No.81373994)；3.北京市教委科技創新平臺項目(No.112219)；4.北京市衛生系統高層次衛生技術人才培養計劃項目(No.2011-3-097)。

1.河北北方學院，河北張家口市075000；2.首都醫科大學宣武醫院，北京市100053。作者簡介：侯虹麗(1986-)，女，漢族，山西交城縣人，碩士研究生，主要研究方向：神經藥理，中藥藥理。通訊作者：王文。E-mail:lzwwang@163.com。