莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠血管生成素1及其受體Tie-2的影響①

劉婷婷，孫芳玲，程華，艾厚喜，張麗，王文

莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠血管生成素1及其受體Tie-2的影響①

劉婷婷，孫芳玲，程華，艾厚喜，張麗，王文

目的觀察莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠血管生成素1(Ang-1)及其受體Tie-2的影響。方法20只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術組，模型組，莫諾苷小、中、大劑量組，每組4只。線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞模型，術后予莫諾苷30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg每天1次灌胃。術后7 d采用Western blotting法分析皮層Ang-1及其受體Tie-2的表達。結(jié)果模型組患側(cè)皮層Ang-1、Tie-2的表達均比假手術組明顯增加(P＜0.01)。莫諾苷大劑量組Ang-1、Tie-2的表達較模型組明顯提高(P＜0.01)，莫諾苷中、大劑量組Tie-2的表達較模型組顯著提高(P＜0.001)。結(jié)論莫諾苷能上調(diào)局灶性腦缺血大鼠缺血再灌注皮層Ang-1及受體Tie-2的表達，促進血管再生。

莫諾苷；腦缺血再灌注；血管生成素1；Tie-2；血管再生；大鼠

[本文著錄格式]劉婷婷，孫芳玲，程華，等.莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠血管生成素1及其受體Tie-2的影響[J].中國康復理論與實踐,2015,21(1):9-11.

CITED AS:Liu TT,Sun FL,Cheng H,et al.Effects of morroniside on expression of Angiopoietin-1 and Tie-2 in rats after focal cerebral ischemia-reperfusion[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):9-11.

缺血性腦卒中是腦卒中最常見類型，嚴重威脅人類健康[1]。動物實驗證實，缺血性腦卒中后，神經(jīng)血管單元的微環(huán)境改變，誘導血管發(fā)生。形態(tài)學分析表明，缺血后2～7 d梗死灶周邊可見毛細血管重建，缺血半暗帶擴大，且有壁薄的血管形成，并在缺血后2～28 d逐漸發(fā)展成小血管，通過發(fā)芽和套疊的方式延伸到缺血中心區(qū)[2]。新生血管為新生神經(jīng)元提供重要的神經(jīng)營養(yǎng)來源[3]，神經(jīng)祖細胞也會沿著新生血管遷移到梗死周邊區(qū)[4-5]。Navarro-Sobrino等證明，腦缺血后血管新生是形成大腦新生微血管的重要過程，可以改善缺血周邊區(qū)域的組織低灌注[6]。缺血性腦損傷患者腦內(nèi)新生血管密度與患者的生存時間存在一定關系，新生血管密度增加多的患者，預后較好[7]。疾病刺激機體自身的血管新生反應短暫而微弱，不足以很好改善腦缺血后的神經(jīng)功能恢復。通過外源性藥物或其他手段刺激血管新生，可能能更好地促進缺血性腦損傷后的神經(jīng)康復。

血管生成素1(Angiopoietin-1,Ang-1)是血管生成素家族的重要成員，Tie-2是其內(nèi)皮特異性酪氨酸激酶受體。研究表明，Ang-1/Tie-2系統(tǒng)在血管生成過程中

起關鍵作用[8-9]。Beck等證明，在腦缺血后恢復期，Ang-1/Tie-2水平的上調(diào)可以促進腦缺血邊緣帶新生血管形成[10]。另外，缺血后Ang-1能促進神經(jīng)發(fā)生和血管發(fā)生過程的緊密聯(lián)系[11]。

莫諾苷是本課題組從中藥山茱萸中篩選出的有效成分，前期研究顯示，莫諾苷可以明顯改善腦缺血再灌注引起的神經(jīng)功能缺損，減少大腦梗死體積，使神經(jīng)元死亡減少，起到神經(jīng)保護作用[12-14]。我們發(fā)現(xiàn)，莫諾苷能夠促進大鼠腦缺血后梗死灶周邊皮層區(qū)域血管密度增加。因此，本研究在大鼠腦缺血再灌注模型上進一步對莫諾苷對血管生成相關因子Ang-1及Tie-2表達的影響進行研究，為莫諾苷對大鼠缺血性腦損傷后血管新生的作用及機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

莫諾苷由首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥物研究室從山茱萸中提取制備，HPLC分析純度大于98.5%。Ang-1兔多抗(BA0636)：武漢博士德生物工程有限公司。Tie-2兔多抗(sc-324)：美國SANTA CRUZ公司。β-actin鼠單抗(TA-09)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(ZB-2301)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗(ZB-2010)：北京市中杉金橋生物技術有限公司。RIPA裂解液(P0013B)：碧云天生物技術研究所。BCA法蛋白定量試劑盒(P1511)：北京普利萊基因技術有限公司。ECL Western Blotting Kit(32109)：美國THERMO-PIERCE公司。

1.2 實驗動物分組及給藥

20只SPF級Sprague-Dawley雄性成年大鼠，體質(zhì)量260～280 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號：SCXK(京)2007-0001。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型后，隨機分為假手術組，模型組，莫諾苷小、中、大劑量組，每組4只。術后莫諾苷小、中、大劑量組予莫諾苷30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg每天1次灌胃給藥，連續(xù)7 d，假手術組和模型組予等量生理鹽水。

1.3 模型制備

采用改良Longa線栓法[15]。大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于鼠板上，頸部正中切口，鈍性分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈和頸總動脈近心端，動脈夾與頸總動脈近心端之間結(jié)扎一道縫合線，不扎緊。在頸總動脈接近頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處用眼科剪做一斜行細切口，將直徑為0.26 mm的尼龍線插入，稍扎緊縫合線，推動尼龍線進入頸內(nèi)動脈，至距頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處約2 cm時，會有阻擋感，說明栓線已越過大腦中動脈，到達大腦前動脈的起始部。記錄阻塞開始時間，結(jié)扎頸總動脈上端。縫合肌肉、皮膚。阻塞后30 min(若此時大鼠已蘇醒則需要再次麻醉)，拔出尼龍線。

假手術組除不插入尼龍線外，其他操作相同。

1.4 模型成功及評價標準

參照Longa及Bederon評分方法[15-16]對實驗動物進行神經(jīng)行為學評分。將0分、1分及4分大鼠剔除，并補充各組設計所需大鼠數(shù)量。

1.5 Western blotting

術后7 d，大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉。迅速剝離大腦并將腦膜剝?nèi)ィ〕龌紓?cè)皮層包入錫箔紙中，放入液氮中凍存片刻，-80℃保存。取患側(cè)皮層于5 ml EP管中稱重，加入預冷的裂解液7 μl/mg組織、PMSF 1 μl/100μl RIPA，冰上充分超聲粉碎。4℃靜止30 min，4℃12000 r/min離心30 min。取上清測定蛋白濃度，總蛋白與5×上樣緩沖液1∶4稀釋，95℃變性10 min。

Ang-1采用10%SDS-PAGE分離膠，Tie-2采用8%SDS-PAGE分離膠；濃縮膠用5%SDS-PAGE。電泳：濃縮膠電壓60 V，40 min，分離膠電壓90 V，90 min，分離蛋白。電泳后用0.45 μm NC膜進行轉(zhuǎn)膜；條帶在5%脫脂奶粉中封閉2 h；分別用兔多克隆Ang-1抗體(1∶200)、兔多克隆Tie-2抗體(1∶200)和小鼠單克隆β-actin抗體(1∶1000)，4℃冰箱孵育過夜。TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。加相應辣根過氧化物酶結(jié)合二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min；ECL顯色1 min，濾去顯色液，凝膠成像儀拍片。用Quanity One軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 Ang-1

模型組Ang-1水平比假手術組明顯升高(P＜0.01)；與模型組大鼠相比，莫諾苷大劑量組Ang-1水

平明顯增加(P＜0.01)。莫諾苷小、中劑量組表達水平與模型組相比有升高趨勢，但無顯著性差異。見表1。

2.2 Tie-2

模型組Tie-2水平較假手術組顯著升高(P＜0.001)；與模型組大鼠相比，莫諾苷中、大劑量組皮層Tie-2蛋白表達顯著增加(P＜0.001)。莫諾苷小劑量組表達水平與模型組相比有升高趨勢，但無顯著性差異。見表1。

表1 各組患側(cè)皮層Ang-1、Tie-2灰度比較(/β-actin)

3 討論

在血管新生過程中，Ang-1/Tie-2對于新生血管的形成、重塑、穩(wěn)定、成熟都起舉足輕重的作用[17]。Ang-1/Tie-2特異性表達于內(nèi)皮細胞和早期造血細胞[18]。受體Tie-2在大腦發(fā)育中的脈管系統(tǒng)內(nèi)表達量較高，但成年后表達量維持在較低水平。Ang-1與其受體Tie-2結(jié)合后可以促進新生內(nèi)皮細胞存活，調(diào)節(jié)血管萌芽和分枝形成，募集內(nèi)皮周圍支持細胞，最終促進血管重塑和成熟[19-20]。

腦缺血后，大腦皮層內(nèi)Ang-1與Tie-2蛋白及mRNA表達水平均增加，這對于缺血后梗死周邊區(qū)域殘存血管結(jié)構(gòu)的維持、大規(guī)模血管重塑和血管新生起到關鍵作用[21-22]。Beck等發(fā)現(xiàn)，缺血性腦損傷后，Ang-1/Tie-2水平的上調(diào)在時空和數(shù)量上調(diào)節(jié)梗死中心及半暗帶新生血管和側(cè)支循環(huán)的形成，促進腦血流恢復，改善缺血周邊能量代謝，促進功能恢復[10]。

本研究顯示，大鼠腦缺血再灌注7 d后，大腦患側(cè)皮層Ang-1和Tie-2蛋白表達升高，與上述結(jié)果一致，提示缺血性腦損傷刺激促血管新生因子的生成，使神經(jīng)血管單元的微環(huán)境發(fā)生改變。給予莫諾苷治療后，Ang-1和Tie-2蛋白表達水平進一步增加。結(jié)合前期研究結(jié)果，我們推斷莫諾苷能夠通過調(diào)節(jié)局灶性腦缺血后Ang-1及其受體Tie-2的表達，在一定程度上改善腦內(nèi)神經(jīng)血管單元微環(huán)境，實現(xiàn)促血管新生的作用，在缺血性腦損傷的治療中有著良好前景。

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Effects of Morroniside on Expression of Angiopoietin-1 and Tie-2 in Rats after Focal Cerebral Ischemia-reperfusion

LIU Ting-ting, SUN Fang-ling,CHENG Hua,AI Hou-xi,ZHANG Li,WANG Wen.Department of Pharmacology,Xuanwu Hospital of Capital Medical University,Beijing Geriatric Medical Research Center,Beijing 100053,China

Objective To explore the effects of morroniside on the expression of Angiopoietin-1(Ang-1)and Tie-2 in a rat after focal cerebral ischemia-reperfusion.Methods 20 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=4),ischemia group(n=4), and morroniside groups(low,medium and high dosage groups,n=4).The middle cerebral artery were occluded for 30 min,and re-perfused. Morroniside was administered intragastrically once a day at dose of 30 mg/kg,90 mg/kg and 270 mg/kg after operation.The expression of Ang-1 and Tie-2 in the ischemic ipsilateral cortex were detected with Western blotting analysis 7 days after operation.Results The expression of Ang-1 and Tie-2 increased in the ischemia group compared with the sham group(P＜0.01),and both of them further increased in the morroniside groups of high dosage compared with the ischemia group(P＜0.01),and the expression of Tie-2 also increased in the morroniside groups of medium dosage(P＜0.001).Conclusion Morroniside could increase the expression of Ang-1 and Tie-2 in the ischemic ipsilateral cortex after ischemia-reperfusion in rats,suggesting promoting the angiogenesis after ischemia.

morroniside;ischemia-reperfusion;Angiopoietin-1;Tie-2;angiogenesis;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.003

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0009-03

2014-11-24

2014-12-11)

1.“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(No.2012ZX09102201-016)；2.國家自然科學基金項目(No.81173575；No.81373994)；3.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院院級課題。

首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院動物實驗室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京重大疾病研究院，北京市100053。作者簡介：劉婷婷(1988-)，女，漢族，河北滄州市人，博士研究生，主要研究方向：神經(jīng)藥理。通訊作者：王文，男，博士，教授，博士生導師。E-mail:lzwwang@ 163.com。