電針對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力及RhoA蛋白表達的影響①

吳羽楠，張蘊，林如輝，陳立典，陶靜

電針對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力及RhoA蛋白表達的影響①

吳羽楠1，張蘊2，林如輝3，陳立典4，陶靜1

目的探討電針神庭、百會穴對腦缺血再灌注模型大鼠學習記憶能力的影響及其可能機制。方法45只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術組(n=15)、模型組(n=15)和電針組(n=15)。模型組和電針組均采用左側大腦中動脈缺血(MCAO)再灌注模型。電針組電針神庭、百會穴共7 d。采用Morris水迷宮測試觀察大鼠學習記憶能力；尼氏染色觀察大鼠海馬神經元形態結構變化；Western blotting法檢測大鼠左側海馬RhoA蛋白的表達。結果與模型組相比，電針組學習記憶能力改善(P＜0.05)，海馬神經元損傷減少(P＜0.05)，海馬組織中RhoA蛋白表達降低(P＜0.05)。結論電針能夠改善腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力，其機制可能與抑制RhoA蛋白表達有關。

腦缺血；電針；學習記憶；RhoA；大鼠

[本文著錄格式]吳羽楠，張蘊，林如輝，等.電針對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力及RhoA蛋白表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2015,21(1):17-21.

CITED AS:Wu YN,Zhang Y,Lin RH,et al.Effects of electroacupuncture on learning and memory ability and RhoA expression in rats after cerebral ischemic-reperfusion[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):17-21.

腦卒中是目前常見的導致死亡和殘疾的原因之一[1]。據調查，腦卒中后1個月內，認知功能障礙發生率約30%[2]，患者在康復治療中主動配合能力嚴重受限，從而影響總體功能康復。針刺神庭、百會穴是治療認知功能障礙行之有效的方法，但其機制尚不明確[3-5]。RhoA是Rho蛋白家族的主要成員，可與三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate,GTP)結合參與細胞間信號轉導。RhoA蛋白活化可抑制軸突出芽、生長，縮短樹突長度[6-7]。研究表明，大鼠腦缺血后，缺血海馬CA1區RhoA表達升高，而抑制RhoA表達可明顯改善缺血大鼠學習記憶功能[8]。本研究觀察電針神庭、百會穴對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力、海馬神經元形態結構及RhoA蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級雄性健康Sprague-Dawley大鼠45只，體質

量(250±30)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號：SCXK(瀘)2012—0002。于福建中醫藥大學實驗動物中心適應性喂養。采用隨機數字表法將所有大鼠編號，分為假手術組(n=15)、模型組(n= 15)、電針組(n=15)。實驗過程均嚴格按照國際動物保護和使用指南的規定進行。

1.2 主要試劑和儀器

尼氏染色液：上海碧云天生物技術有限公司。RhoA一抗：ABCAM公司。β-actin一抗、辣根過氧化物酶二抗：CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。Morris水迷宮：中國醫學科學院藥物研究所。Image-lab圖像分析系統：BIO-RAD LABORATORIES公司。

1.3 模型制備

術前12 h大鼠禁食。參照改良Longa方法[9]制備左側大腦中動脈閉塞模型。大鼠稱重后10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉。頸前正中開口，充分暴露并鈍性分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈。結扎頸總動脈近心端及分叉處頸外動脈，微動脈夾夾閉頸內動脈。在頸總動脈結扎處附近剪一小口，將備好的栓線插入頸內動脈，插入長度18.0～22.0 mm。撤去頸內動脈血管夾，緩慢推動栓線至大腦前動脈近端。固定栓線，縫合傷口。2 h后回抽栓線至頸總動脈分叉處，形成缺血再灌注模型。假手術組只分離動脈，不結扎、插線。手術結束后，動物放置于室溫(24℃)環境下蘇醒，正常喂養。

動物蘇醒后按Longa評分判斷模型是否成功：0分，無神經功能缺損體征；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，向偏癱側轉圈；3分，行走時向偏癱側傾倒；4分，不能自發行走，意識喪失。評分1～3分者納入實驗。

1.4 干預方法

假手術組置于普通籠中飼養，予同等條件抓取。模型組造模后回籠飼養，予同等條件抓取。電針組參考《實驗針灸學》取大鼠神庭和百會穴，使用華佗牌30號0.5寸毫針，接G6805電針儀，電壓峰值6 V，以針體輕輕抖動為度，疏密波，頻率1～20 Hz。每次30 min，每天1次，共7 d。于手術后第2天開始治療，直至動物被處死。

1.5 Morris水迷宮測試

于術后3 d進行。水迷宮水池圓桶形，直徑120 cm，深50 cm，水深30 cm，水溫(26±2)℃。池壁4個等距離點分水池為4個象限，池壁外標4個入水點，任選一象限在其中央放置平臺。平臺直徑6 cm，高28 cm，沒于水面下2 cm，水池周圍參照物保持不變。共訓練4 d。

1.5.1 定位航行實驗(place navigation)

將大鼠按順時針方向依次由第1象限、第2象限、第3象限、第4象限入水點順序面向池壁放入水中。如果大鼠在90 s內爬上平臺，并停留3 s以上，則認為大鼠找到平臺，記錄逃避潛伏期(escape latency)。如果90 s內大鼠未找到平臺，則拖拽其尾部，將其引導到平臺，停留10 s，潛伏期計為90 s。

1.5.2 空間探索實驗(spatial probe)

術后第7天，撤去平臺，取任意入水點將大鼠放入水中，觀察并記錄90 s內大鼠穿過原平臺區域的次數。

1.6 取材及檢測

1.6.1 尼氏染色

麻醉下開胸，生理鹽水200 ml經左心室快速沖洗，4%多聚甲醛(pH=7.4)400 ml灌流固定。取腦置4%多聚甲醛內，4℃固定24～48 h。定位腦缺血區，常規脫水，石蠟包埋，冠狀切片，片厚5 μm。二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，尼氏染色液染色，中性樹脂封片。光鏡下觀察左側大腦海馬組織CA1區和CA3區尼氏小體變化。于高倍鏡下(×400)隨機選取2個視野，計數殘存的神經元細胞數目，取平均值。

1.6.2 Western blotting

取左側海馬組織置液氮罐中速凍，-80℃冰箱保存。取海馬組織100 mg，加裂解緩沖液1 ml和苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)10 μl，充分研磨后離心，取上清。BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度。樣品蛋白變性后，取樣品蛋白50 μg，12%SDS-PAGE電泳，轉移到PVDF膜，封閉液封閉2 h，分別用RhoA、β-actin一抗(1∶1000)孵育，4℃過夜，用辣根過氧化物標記的二抗(1∶5000)室溫孵育1 h。將PVDF膜放圖像掃描儀上，避光配置顯色液并覆蓋PVDF膜，Image-lab圖像分析系統分析。

1.7 統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件進行統計分析。所有數據均滿足方差齊性(P＞0.05)，以(±s)表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。顯著性水平α= 0.05。

2 結果

2.1 Morris水迷宮測試

隨著訓練時間增加，各組大鼠逃避潛伏期呈逐漸縮短趨勢。從術后3 d起，與假手術組相比，模型組逃避潛伏期明顯延長(P＜0.01)；與模型組相比，電針組逃避潛伏期時間縮短(P＜0.05)。術后7 d，模型組大鼠跨越平臺次數比假手術顯著減少(P＜0.001)，電針組比模型組增加(P＜0.05)。見表1。

2.2 尼氏染色

假手術組海馬CA1、CA3區錐體細胞形態結構完整，排列緊密，核膜核仁清晰，大量活性神經元存在。模型組海馬CA1、CA3區神經元細胞大量丟失，殘存神經元固縮破裂，排列疏松，核仁消失，出現空泡樣變。電針組海馬CA1、CA3區神經元細胞結構較完整性(圖1)。

與假手術組相比，模型組海馬CA1、CA3區神經元減少，電針組神經元數比模型組增多(P＜0.05)。見表2。

2.3 Western blotting

與假手術相比，模型組海馬RhoA蛋白表達增加(P＜0.05)，電針組RhoA蛋白表達比模型組減少(P＜0.05)。見圖2、表3。

圖1 各組大鼠海馬CA1、CA3區神經元(尼氏染色,400×)

表2 各組大鼠海馬CA1、CA3區存活神經元數比較(/HD)

表3 各組大鼠海馬RhoA表達比較(/β-actin)

圖2 各組大鼠海馬組織RhoA蛋白表達

3 討論

督脈屬于奇經八脈之一，上至風府，入屬于腦，總督一身之陽脈，是“陽脈之海”，歷代醫家素有“病變在腦，首取督脈”之說。神庭穴為督脈、足太陽、陽明之會；百會穴為督脈、足太陽之會。神庭、百會穴主要用于治療心神病癥。

海馬區域是重要的學習與記憶的存儲結構[10-11]。腦缺血后會腦萎縮、皮質變薄，神經元細胞發生病理性變化，當這些病理改變發生在海馬等與學習記憶有關的腦區時，便會出現學習記憶障礙[12]。

Morris水迷宮是用于嚙齒類動物學習記憶功能評估的重要工具，由英國生理學家Morris設計，目前已成為一種研究空間學習和記憶機制的標準工具。本研究采用Morris水迷宮初步證實電針神庭、百會可以明顯提高腦缺血再灌注損傷大鼠的學習和記憶能力。同時觀察到，電針可以減輕腦缺血再灌注對大鼠海馬組織中神經元細胞結構的破壞。

Rho家族蛋白是肌動蛋白細胞骨架的重要調節子，可以將胞外的肌動蛋白調節信號傳導至胞內，在神經元的發生發展過程中有重要作用，包括軸突的生長和延伸，樹突棘的形成和維持[13]。RhoA是Rho家族Rho亞族中的成員。RhoA激活可以抑制軸突出芽和生長，其細胞內信號傳遞可能機制為髓鞘抑制因子Nogo-A、髓磷脂相關糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和少突膠質細胞/髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte/myelin glycoprotein,OMGP)的激活，作用于Nogo-66受體(NgR)，激活RhoA，通過其下游Rho激酶調節肌動蛋白的活動，繼而引起軸突生長錐的崩潰[14-16]。同時，活性RhoA可以縮短樹突的長度，其可能機制為RhoA可以激活下游Rho激酶，Rho激酶直接引起肌球蛋白輕鏈(myosinlight chain,MLC)磷酸化，形成磷酸化MLC(myosinlight chain phosphatase, MLCP)，并最終導致肌球蛋白回縮[17-18]。

突觸的可塑性是突觸發育及神經通路重塑的先決條件，也是學習和記憶的形態學基礎[19]。大鼠腦缺血再灌注后，缺血區周圍腦組織RhoA表達升高，抑制RhoA可明顯改善缺血大鼠學習記憶功能。推測RhoA在腦缺血后學習記憶功能的恢復中起著重要作用。本研究中，電針組RhoA蛋白表達減少與大鼠學習記憶能力的變化一致，提示電針促進腦缺血再灌注大鼠認知功能的恢復可能通過調節RhoA的表達實現。

綜上所述，電針神庭、百會能夠改善腦缺血大鼠學習記憶能力，其作用機理可能與電針治療能夠抑制腦缺血再灌注大鼠海馬RhoA蛋白的表達以及其對腦缺血再灌注大鼠海馬的神經保護作用有關。

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Effects of Electroacupuncture on Learning and Memory Ability and RhoA expression in Rats after Cerebral Ischemic-reperfusion

WU Yu-nan,ZHANG Yun,LIN Ru-hui,CHEN Li-dian,TAO Jing.College of Rehabilitation Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350108,China

Objective To explore the effects of electroacupuncture at Shenting(DU24)and Baihui(DU20)on learning and memory ability in the cerebral ischemia-reperfusion rats and its possible mechanism.Methods 45 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=15),ischemia group(n=15)and electroacupuncture group(n=15).The latter 2 groups were modeled as focal cerebral ischemia-reperfusion injury,and the electroacupuncture group received electroacupuncture at Shenting(DU24)and Baihui(DU20)for 7 days. They were tested with Morris Water Maze,observed with Nissl's staining.The protein expression of RhoA was detected with Western blotting.Results The learning and memory ability improved in the electroacupuncture group(P＜0.05),the injury of the neurons reduced(P＜0.05)and the expression of RhoA in hippocampus decreased compared with the ischemia group(P＜0.05).Conclusion Electroacupuncture could ameliorate the learning and memory ability in ischemia-reperfusion rats,which may relate with the inhibition of the expression of RhoAin hippocampus.

electrocerebral ischemia;acupuncture;learning and memory;RhoA;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.005

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0017-05

2014-09-18

2014-11-06)

福建省康復技術協同創新中心資助項目(No.X2012004-協同)。

1.福建中醫藥大學康復醫學院，福建福州市350108；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱市150040；3.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州市350108；4.福建中醫藥大學，福建福州市350108。作者簡介：吳羽楠(1989-)，女，漢族，福建福州市人，碩士研究生，主要研究方向：腦血管病的中西醫結合康復治療。通訊作者：陶靜(1977-)，女，漢族，江蘇淮安市人，博士，副教授，碩士研究生導師，主要研究方向：腦血管病的中西醫結合康復治療。E-mail:taojing01@163.com。