局灶性腦缺血再灌注大鼠神經血管單元的空間構筑①

金媛媛，胡靜，馮璐，李楊，陳燁鋆，胡曉松，李帥

局灶性腦缺血再灌注大鼠神經血管單元的空間構筑①

金媛媛1a，胡靜1a，馮璐1a，李楊1a，陳燁鋆1a，胡曉松1b，李帥1b

目的研究局灶性腦缺血不同再灌注時間段大鼠腦血管、神經元和星形膠質細胞的空間構筑。方法24只Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術組(n=8)和模型組(n=16)，模型組再平均分為再灌注1 d和2周兩個亞組。線栓法大鼠大腦中動脈閉塞1 h后再灌注。各組活體灌注明膠墨汁。按時間取腦組織冰凍連續切片，免疫組織化學法觀察膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、神經元核心抗原(NeuN)的表達。結果血管在皮質或神經核等處分布較多，多數星形膠質細胞突起與血管及神經元接觸。模型組缺血側GFAP表達較假手術組持續增多，NeuN表達減少。再灌注1 d缺血側血管數目明顯減少，再灌注2周后增多，但仍低于假手術組及非缺血側。結論觀察到腦缺血再灌注大鼠神經血管單元的構筑。

局灶性腦缺血；再灌注；神經血管單元；空間構筑；大鼠

[本文著錄格式]金媛媛，胡靜，馮璐，等.局灶性腦缺血再灌注大鼠神經血管單元的空間構筑[J].中國康復理論與實踐, 2015,21(1):31-34.

CITED AS:Jin YY,Hu J,Feng L,et al.Spatial organization of neurovascular unit after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats[J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):31-34.

由神經元及其相關的膠質細胞、內皮細胞等組成的功能單元，被稱之為“神經血管單元”(neurovascular unit,NVU)。NVU是美國國立神經病學與卒中研究所(National Institute of Neurological Disorders and Stroke,NINDS)2002年提出的腦卒中治療的概念模型[1]，這個概念將血管、神經元及神經膠質細胞的相互作用看作一個整體進行研究。腦缺血后，隨著多種炎癥介質的釋放，發生血腦屏障受損、通透性增大，神經元變性壞死、膠質細胞增生等一系列復雜的病理變化。為了解作為結構功能一體化的NVU空間構筑改變，本研究采用線栓法制作大腦中動脈閉阻(MCAO)模型[2]，通過明膠墨汁灌注、免疫組化等方法觀察腦血管、星形膠質細胞和神經元時空變化情況。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

清潔級Sprague-Dawley大鼠24只，體質量(250± 40)g，雌雄不拘，由四川達碩生物有限公司提供。兔抗大鼠膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein, GFAP)、小鼠抗大鼠神經元核心抗原(neuronal nuclear antigen,NeuN)：美國ABCAM公司。Polymer雙染檢

測試劑盒、兔二抗PV6001、鼠二抗PV6002：北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗動物分組

實驗動物編號后，用Excel隨機數發生器產生隨機數字，將大鼠隨機分為假手術組、缺血再灌注1 d和2周模型組，每組8只。

1.3 模型制備

大鼠術前禁食12 h，稱重。3.6%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉。仰臥位固定于手術臺上。取頸正中切口，逐層切開暴露左側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，在近心端結扎頸總動脈和頸外動脈，于頸總動脈結扎的遠心端剪一小口，刺入浸于2.5×106U/L肝素鈉的長5 cm、直徑0.26 mm、頭端圓鈍的尼龍線，經頸總動脈分叉部進入頸內動脈約(19.0±0.5) mm，輕微遇阻即止。固定尼龍線并全層縫合切口。1 h后抽出尼龍線實現再灌注。假手術組插入尼龍線長度10 mm，其他步驟同模型組。

1.4 神經功能缺損評分

麻醉清醒后，采用Longa法[5]對動物進行神經功能缺損評分，判斷模型是否成功。評分標準：0分，無神經功能缺失癥狀；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，爬行時出現對側轉圈；3分，行走時向對側傾倒；4分，不能自發行走，意識喪失。將評分為1～2分的大鼠納入模型組。

1.5 墨汁灌注與取材

動物按預定再灌注時間腹腔注射過量3.6%水合氯醛。仰臥位固定，剪開腹壁，暴露并剪開膈肌，剪開胸腔，暴露心臟。用眼科剪在心尖處剪一切口，將灌注針插入左心室，并于右心耳處剪一小口。向主動脈方向灌入37℃生理鹽水，直至右心耳流出清亮的液體。經左心室在大鼠平均動脈壓下灌注37℃含3%明膠的墨汁20 ml；再在180%大鼠平均動脈壓下灌注含5%明膠的37℃墨汁30 ml。結扎主動脈，將大鼠立即放于4℃冰箱中2 h，以利于明膠凝固，防止墨汁流失。用組織剪將大鼠頸部剪開，咬骨鉗咬開顱骨，完整取出大腦，立即置于-80℃冰箱中保存待檢。

腦組織從冰箱中取出，置10%中性甲醛液固定24 h，再浸入30%蔗糖溶液中，常溫下至標本沉底(防止冰晶形成)。-15℃恒冷連續冰凍切片，片厚5 μm，每隔5張取1張，吹干后置-80℃冰箱中保存。

1.6 免疫組化雙標記法

采用Envision二步法進行。切片加入梯度乙醇浸水，0.01 mol/L PBS液(pH=7.2)洗3次，每次3 min，高壓修復4 min；PBS洗3次。加入3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶10 min，PBS洗3次；羊血清封閉，滴加GFAP(1∶500)和NeuN(1∶200)一抗4℃冰箱過夜；復溫，PBS洗3次，滴加二抗，37℃恒溫箱中40 min，PBS洗3次。DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，封片。

1.7 免疫雙染檢測法

一抗GFAP、NeuN分別按1∶250和1∶100稀釋，嚴格按雙染試劑盒說明書進行冰凍切片染色。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 血管

再灌注1 d，模型組缺血側紋狀體區血管數較假手術組及非缺血側明顯減少(P＜0.01)，并且觀察到部分血管通透性增高；再灌注2周，缺血側紋狀體區血管數較假手術組及非缺血側減少(P＜0.05)，但較再灌注1 d時增加(P＜0.05)。見表1。

表1 各組紋狀體區血管數比較(n)

2.2 免疫組化

假手術組觀察到NeuN在神經元胞核和胞漿中表達。再灌注1 d，缺血側NeuN陽性細胞數較假手術組及非缺血側明顯減少(P＜0.01)；再灌注2周，缺血側NeuN陽性細胞數較假手術組及非缺血側明顯減少(P＜0.01)。見表2。2周時，部分缺血中心區可見少量存活NeuN陽性細胞，呈條索狀分布，其內常見血管存在(圖1)。

表2 各組NeuN陽性細胞數比較(n)

假手術組GFAP陽性表達胞體小，突起細，數量少(圖1)。再灌注1 d，缺血側胼胝體區GFAP陽性細胞數目較假手術組及非缺血側增加(P＜0.05)；再灌注2周，缺血側GFAP陽性細胞數較假手術組及非缺血側明顯增加(P＜0.01)。見表3。

血管主要分布在皮質或神經核等處，神經元分布密集的區域血管分布也相對密集。星形膠質細胞主要分布在血管的周圍。星形膠質細胞通過細胞突起與神經元發生聯系，同時星形膠質細胞突起末端終足包裹著血管，充當神經元與血管之間的紐帶與橋梁作用(圖1)。

表3 各組胼胝體GFAP陽性細胞數比較(n)

圖1 血管、NeuN、GFAP分布

3 討論

NVU的概念強調神經元、膠質細胞、血管在結構和功能上的整體性，并且重視不同細胞成分間的相互作用和相互聯系。有研究表明，NVU中，星形膠質細胞參與包裹血管壁99%以上面積，并與內皮細胞相互影響和作用，具有增加緊密連接，減少縫隙連接的作用[3]。星形膠質細胞也通過突起與神經元發生聯系。因此，星形膠質細胞在神經元與血管之間發揮重要的紐帶與橋梁作用，介導NVU各組分間的相互作用[4]。

本研究觀察到，腦缺血后，多數激活的星形膠質細胞通過突起與血管及神經元接觸，缺血區NeuN陽性細胞減少，并隨再灌注時間延長進一步減少；同時缺血區血管數減少，并可見明膠墨汁外滲到血管外的血管壁受損情況。此外，在假手術組及非缺血側腦組織，血管數在皮質區最多，CPU區較少，提示血管分布與神經元密度及其相應的功能一致[5]。

腦血管在神經網絡中扮演重要角色。許多生理和行為會影響神經系統血管的形態結構。應用明膠墨汁灌注法研究血管的形態結構的變化取得了較好的效果[6-7]。明膠屬動物蛋白，易溶于溫水，冷卻后形成凝膠，其溶解度與凝固溫度相差很小。明膠墨汁的濃度較高，導致微血管灌注不充分；3%和5%明膠墨汁配合使用，可使血管的各級分支灌注更充分[8-12]。

本研究觀察到，假手術組灌注后，腦組織表面黑色分布均勻，而模型組缺血側明膠墨汁灌注黑色分布較非缺血側少，與文獻報道一致[13]。從灌注的腦組織

的表面觀察，提示應用明膠墨汁進行灌注時，明膠墨汁的濃度、溫度、灌注量以及灌注時壓力大小對于灌注結果都有影響。

NVU概念的提出是基于改善脈管系統及其他微環境成分，以減輕腦卒中、腦損傷和神經退行性變而導致的包括神經元、神經膠質細胞和血管細胞在內的神經細胞死亡的癥狀。急性缺血性腦卒中可快速觸發NVU損傷，導致血腦屏障等發生變化，通過血腦屏障損傷機制導致腦水腫、炎性細胞浸潤等繼發性腦損傷[14]。本研究應用明膠墨汁顯示血管、用GFAP/NeuN免疫組化雙標記法在同一個組織切片中同時標記星形膠質細胞和神經元，較好顯示NVU的空間構筑關系；觀察到星形膠質細胞突起末端終足包裹血管，星形膠質細胞通過細胞突起與神經元發生聯系，提示星形膠質細胞在神經元與血管之間起著紐帶與橋梁作用[15]。與其他應用類似的研究[7-8,10]相比，本研究行免疫雙標染色，更好地顯示血管、神經元和星形膠質細胞三者之間的空間關系。

本研究尚有不足之處。為了清晰觀察細胞形態，切片較薄，行免疫組織化學復染后，部分纖細的血管墨汁顯色較淡。可嘗試適當增加切片厚度或改善墨汁明膠的比例，在不影響細胞形態觀察的基礎上更好地顯示微細血管。

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Spatial Organization of Neurovascular Unit after Focal Cerebral Ischemia-reperfusion in Rats

JIN Yuan-yuan,HU Jing,FENG Lu, LI Yang,CHEN Ye-yun,HU Xiao-song,LI Shuai.Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China

Objective To investigate the spatial organization of neurons,blood vessel and astrocytes at different time of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats.Methods 24 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=8),reperfusion 1 day group and reperfusion 2 weeks group.The latter 2 groups were occluded the middle cerebral arteries for an hour and reperfused.All the rats were injected with gelatin ink.The expressions of glial fibrillary acid protein(GFAP)and neuronal nuclear antigen(NeuN)in the brain were observed with immunohistochemistry.Results The vessels located mainly in cortex and nucleus.Most of astrocytes apophysis connected with vessels and neurons.Compared to the sham group,the expression of GFAP increased significantly in ischemic side,and the expression of NeuN decreased 1 day and 2 weeks after ischemia-reperfusion.The vessels decreased in the ischemic side 1 day after cerebral ischemia-reperfusion,and then increased 2 weeks later.Conclusion The organization of neurovascular unit after cerebral ischemia-reperfusion has been observed.

focal cerebral ischemia;reperfusion;neurovascular unit;spatial organization;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.008

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0031-04

2014-08-18

2014-09-19)

成都醫學院大學生創新性實驗項目基金資助(No.CXXS201304)。

1.成都醫學院，a.臨床醫學系；b.形態學實驗室，四川成都市610500。作者簡介：金媛媛(1991-)，女，河南商丘市人，本科生。通訊作者：胡曉松(1972-)，男，四川廣安市人，碩士，副教授，碩士研究生導師，主要研究方向：腦缺血損傷及修復研究。E-mail:woodwind@sohu. com。