即時高壓氧對大鼠局灶性腦缺血后梗死體積的影響①

李綱，張志強，張立新

即時高壓氧對大鼠局灶性腦缺血后梗死體積的影響①

李綱，張志強，張立新

目的探討即時高壓氧對大鼠局灶性腦缺血后梗死體積的影響。方法Sprague-Dawly大鼠隨機分成對照組(n=9)、高壓空氣組(n=9)、高壓氧組(n=9)、假手術組(n=5)，前三組應用線栓法制作大鼠局灶性腦缺血模型，高壓空氣組、高壓氧組在高壓氧艙內造模，高壓氧組于造模后立即行高壓氧治療。各組大鼠均于術后6 h斷頭取腦，計算各組大鼠腦梗死占腦總體積百分比。結果與對照組相比，高壓氧組及高壓空氣組梗死百分比均顯著減少(P＜0.001)，高壓氧組減少得更顯著(P＜0.001)。結論即時高壓氧治療能夠降低大鼠腦局灶性缺血后梗死體積。

腦缺血；即時高壓氧；梗死體積；大鼠

[本文著錄格式]李綱，張志強，張立新.即時高壓氧對大鼠局灶性腦缺血后梗死體積的影響[J].中國康復理論與實踐,2015, 21(1):39-41.

CITED AS:Li G,Zhang ZQ,ZHANG LX.Effect of immediate hyperbaric oxygen on infarct size in rats after focal cerebral ischemia[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):39-41.

腦是人體最重要的器官。腦組織質量僅占體質量的2%～3%，但其需氧量卻占全身供給量的20%～25%，腦組織中幾乎無葡萄糖和氧的儲備，對缺血缺氧耐受性極差。腦血管病是目前世界上公認的嚴重威脅人類健康的疾病之一，發病率高，死亡率高，致殘率高。目前認為，溶栓治療、神經影像及氧療對患者功能恢復極為重要。若能在腦卒中發病數小時內用先進的神經影像學確定診斷，并及時正確地采取高壓氧治療，可以為溶栓或應用神經保護藥物爭取時間。早期溶栓治療非常有效[1]；“神經保護”可以阻斷一種或多種缺血細胞死亡途徑，從而改善腦卒中的預后。但目前腦卒中藥物治療存在兩個致命的弱點：①由于溶栓治療時間窗較短(3 h)，臨床上只有5%左右的腦卒中患者受益；②雖然神經保護藥物在動物研究中顯示有一定療效，但目前沒有任何一種神經保護藥在三期臨床研究中取得令人滿意的療效。所以，既能安全地挽救缺血神經元，又能為腦卒中溶栓治療擴大治療窗的治療方案將會有很大應用前景[2]。

Acka[3]等、Li等[4]的研究顯示，高壓氧治療可有效減少大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型腦梗死體積。目前氧療的治療形式主要有兩種：常壓氧治療和高壓氧治療。醫用氧(氧濃度21%)的氧分壓在1個大氣壓(atmosphere,ATM,1 ATM=760 mmHg=101.325 kPa)的環境中為102 mmHg，常壓氧(氧濃度100%，1 ATM)的氧分壓也只能增至673 mmHg，而高壓氧(氧濃度100%，3 ATM)

可以使氧分壓增至2193 mmHg[5]。Singhal等報道，如果常壓氧治療能在MCAO模型成功后15或30 min內進行，可以顯著減少梗死體積[6]。多數研究表明，高壓氧及常壓氧治療急性缺血性腦卒中有良好的實驗效果，即使高壓氧治療的基本機制仍不十分明確，但高壓氧的治療效果在許多文獻中優于常壓氧。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

手術過程經中國醫科大學倫理委員會審批并且符合動物實驗操作規程。雄性Sprague-Dawley大鼠40只，體質量250～280 g，大鼠飼養于12 h晝夜循環且室溫22～25℃的環境中，自由進食及飲水。大鼠稱重，按體質量從輕到重編號1～40，應用SPSS 13.0中SYNTAX窗口輸入隨機分組程序，將40只大鼠分為以下4組：對照組(n=9)、高壓空氣組(n=9)、高壓氧組(n=9)、假手術組(n=5)，其余8只備用。所有大鼠均在MCAO模型制作成功后6 h，麻醉后處死。

1.2 模型制備

10%水合氯醛0.3～0.5 ml/100 g腹腔注射麻醉并保持自主呼吸，如麻醉不足可適當增加藥量。大鼠仰臥位固定于操作臺上，取頸正中切口，鈍性分離下頜下腺，分離暴露右側頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈。在頸內、頸外動脈分叉處靠近頸總動脈根部結扎頸外動脈，并結扎頸總動脈近心端。用微血管夾快速夾閉頸內動脈，在距頸總動脈根部約0.5 cm處用4、5號針頭扎一直徑約0.35 mm小口，將直徑0.286 mm、頭部沾有硅膠的魚線插入小口，打開血管夾，使魚線進入頸內動脈，當有阻力感時停止進入，進線長度距頸總動脈根部約(18±0.5)mm。將魚線環狀結扎，固定于頸總動脈根部。逐層縫合至皮膚。手術過程用電熱毯維持大鼠肛溫(37.0±0.5)℃。

1.3 干預方法

1.3.1 高壓氧組

應用GY3200型高壓氧艙(煙臺宏遠氧業公司)，參數為升壓20 min，穩壓(2 ATM)65 min，降壓20 min。穩壓后吸100%純氧60 min，中間休息5 min。

大鼠于早8點進入氧艙，于升壓過程(20 min)完成造模。將大鼠置于約1 m3的密閉容器中，連通氧氣管，容器內溫度22～25℃，放入少量碳酸鈣以吸收大鼠呼出的二氧化碳。治療過程及治療后無大鼠出現癲癇癥狀。

1.3.2 高壓空氣組

在同一高壓氧艙內造模，參數相同。將大鼠置于另一個1 m3的容器中，將容器頂蓋去除。不接氧氣管，大鼠呼吸氧艙中的空氣。

1.3.3 對照組

大鼠不進入高壓氧艙中，于早8點造模，置于1 m3容器中。

1.3.4 假手術組

大鼠不進入高壓氧艙中，于早8點手術，步驟同前，只是進線長度為距頸總動脈根部10 mm。術后置于1 m3容器中。

1.4 梗死體積測定

大鼠蘇醒后采用Longa評分判斷模型是否成功：0分，無神經損傷體征；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，行走時向偏癱側轉圈；3分，行走時向偏癱側傾倒；4分，不能自發行走，意識喪失。0分及4分剔除。

術后6 h再次麻醉大鼠，斷頭取腦。腦組織迅速放入-20℃冰箱內冷凍15 min，冠狀切片，厚2 mm。第1刀在腦前極與視交叉連線中點處；第2刀在視交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第4刀在漏斗柄與后葉尾極之間。切片置0.2 mmol/L PBS配成的1%2,3, 5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride, TTC)中，錫箔紙蓋住后，放入恒溫水浴箱，37℃20 min，翻動腦片，使其與染色液均勻接觸。切片取出，置0.1 mol/L PBS配成4%多聚甲醛中固定，24 h后用數碼相機拍照，OSIRIS圖像處理軟件計算梗死體積占全腦的百分比。

1.5 統計學分析

用SPSS 13.0統計軟件對數據進行正態性檢驗，方差齊，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

動物麻醉意外死亡1只，造模失敗3只，均用備用大鼠補足。備用大鼠仍用SPSS 13.0中SYNTAX窗口輸入隨機程序分組。納入統計32只。假手術組未見梗死灶，不對該組數據進行統計分析。

高壓空氣組及高壓氧組梗死體積比均顯著小于對照組(P＜0.001)，高壓氧組顯著小于高壓空氣組(P＜0.001)。

表1 各組大鼠腦梗死體積比(%)

3 討論

腦卒中后，細胞損傷途徑主要有4種：興奮性中毒、氧/一氧化氮超載、炎性反應和細胞凋亡[7]。缺氧是造成上述問題的重要原因，增加體內氧氣水平理論上可以對缺血組織起保護作用。

早期認為，高壓氧可以提高血漿內游離氧濃度達數十倍，從而促進氧分子擴散至缺血組織，減少對血紅素結合氧的依賴。近年報道，高壓氧可以通過生化、分子及血流動力學途徑產生作用。腦缺血缺氧時，ATP生成減少，谷氨酸鹽釋放，鈣離子超載，氧自由基過度產生和炎癥反應造成線粒體損傷。以上病理反應造成了神經細胞凋亡，引起腦水腫和血腦屏障功能減退，最終造成患者死亡或者遺留功能障礙。

Zhang等研究表明，高壓氧能保護血腦屏障，減輕腦水腫；使體內谷氨酸鹽、葡萄糖及丙酮酸鹽相對穩定；能抑制炎癥反應和細胞凋亡；反調節超氧化物歧化酶；增強促進細胞存活基因Bcl-2表達；增加紅細胞變形能力改善微循環減輕缺血-缺氧狀態[8]。Cheng等發現，高壓氧可以減少腦卒中大鼠模型環氧化酶-2 mRNA和蛋白質水平，減少中性粒細胞侵潤，從而抑制炎性反應[9]。還有研究顯示，在缺血再灌注模型中，高壓氧可減少多種凋亡基因表達，如誘導因子-1α、P54、caspase-9及caspase-3。這些抑制炎癥反應和抗細胞凋亡的效應可以促進神經細胞恢復。

本研究顯示，腦缺血后即刻予高壓氧治療，可以減少腦梗死體積。值得一提的是，即刻予高壓空氣治療亦能減少梗死體積，只不過效果較差。

由于梗死體積的測定依賴圖像處理軟件，因此在計算過程中難免造成誤差。本實驗通過同一圖像多次測量取平均值的方法得出最后梗死體積；拍攝時用同一相機、相同參數、固定拍攝距離及選擇自然光相似的條件時間點進行拍攝，盡量減少誤差。但并不能完全避免誤差的產生。

本研究選取的高壓氧介入時間極早，在臨床上很難實現，只能供臨床選擇高壓氧介入時機時借鑒。今后應選取多個時間點介入高壓氧，并觀察多種指標，為臨床工作提供更多依據。

國內外高壓氧治療腦缺血的具體方案有很大不同，高壓氧介入時機、高壓氧治療療程、高壓氧治療劑量等，文獻報道尚無統一意見。本文選取即時高壓氧作為干預因素，國內外鮮有報道，可以完善高壓氧介入時機方面相關研究。

[1]GriessenauerCJ,Foreman P,Deveikis JP,et al.Endovascular tools available for the treatment of cerebrovascular disease[J]. Neuro Clin NAm,2014,25(3):387-394.

[2]Singhal AB.A review oxygen therapy in ischemic stroke[J]. Neurol Res,2007,29(2):173-183.

[3]Acka G,Sen A,Canakci Z,et al.Effect of combined therapy with hyperbaric oxygen an antioxidant on infarct volume after permanent focal cerebral ischemia[J].Physiol Res,2007,56 (3):369-373.

[4]Li Z,Liu W,Kang Z,et al.Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model[J]. Brain Res,2008,27(1196):151-156.

[5]Jain KK.Physical,physiological and biochemical aspects of hyperbaric oxygen[M]//Jain KK.Textbook of Hyperbaric Medicne.Gottingen:Hogrefe&Huber,2004:10-20.

[6]Singhal AB,Dijkhuizen RM,Rosen BR,et al.Normobaric hyperoxia reduces MRI diffusion abnormalities and infarct size in experimental stroke[J].Neurology,2002,58(6):945-952.

[7]Lo EH,Dalkara L,Moskowitz MA.Mechanisms,challenges and opportunities in stroke[J].Nat Rev Neurosci,2003,4(5): 399-415.

[8]Zhang JH,Lo T,Mychaskiw G,et al.Mechanisms of hyperbaric oxygen and neuroprotection in stroke in adult rats[J].Pathophysiology,2005,12(1):63-77.

[9]Cheng O,Ostrowski RP,Wu B,et al.Cyclooxygenase-2 mediates hyperbaric oxygen preconditioning in the rat model of transient global cerebral ischemia[J].Stroke,2011,42(2):484-490.

Effect of Immediate Hyperbaric Oxygen on Infarct Size in Rats after Focal Cerebral Ischemia

LI Gang,ZHANG Zhi-qiang,ZHANG Li-xin.Department of Rehabilitation,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang,Liaoning 110000,China

Objective To investigate the effect of immediate hyperbaric oxygen on focal cerebral ischemia of rats.Methods Sprague-Dawly rats were randomly divided into control group(n=9),hyperbaric air group(n=9),hyperbaric oxygen group(n=9)and sham group(n=5).The middle cerebral arteries were occluded in the former 3 groups,while the hyperbaric air group and the hyperbaric oxygen group operated in the hyperbaric chamber,and the hyperbaric oxygen group accepted hyperbaric oxygen immediately after operation.All the rats were sacrificed 6 hours after operation and the percentage of volume of infarction in the brain slices was calculated.Results The percentage of infarction decreased in both hyperbaric oxygen group and hyperbaric air group compared with the control group(P＜0.001),and decreased more in the hyperbaric oxygen therapy than in the hyperbaric air group(P＜0.001).Conclusion Immediate hyperbaric oxygen therapy can reduce infarct size in rats after focal cerebral ischemia.

cerebral ischemia;immediate hyperbaric oxygen;infarct size;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.010

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0039-03

2014-08-25

2014-09-16)

中國醫科大學附屬盛京醫院康復中心，遼寧沈陽市110000。作者簡介：李綱(1985-)，男，遼寧沈陽市人，碩士，醫師，主要研究方向：高壓氧與腦血管病。通訊作者：張志強。E-mail:zhangzq@sj-hospital.org。