甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料的分子鑒定

劉嬌嬌，王超，王帥

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱，150030）

結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleraceaL.var.capitataL.），屬十字花科蕓薹屬，為一種重要的蔬菜類(lèi)作物。由于不結(jié)球白菜雜種優(yōu)勢(shì)非常明顯，目前國(guó)內(nèi)外主要推廣的品種大多數(shù)為F1代。不結(jié)球白菜雜種一代過(guò)去主要采用自交不親和系繁殖，但繁殖成本較高，且親本生活力易下降，制種時(shí)雜交率很難達(dá)到100%，容易出現(xiàn)假雜種；利用雄性不育系制種，不僅親本繁殖容易、雜種一代純度高，而且有利于新品種的自身保護(hù)。

細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）是一種不能產(chǎn)生有活力花粉的母性遺傳現(xiàn)象，是由線粒體基因組的重排引起的。CMS相關(guān)基因產(chǎn)生一種新的蛋白質(zhì)，直接或間接破壞線粒體正常的生理功能[1]，從而導(dǎo)致花粉敗育，研究證明，高等植物CMS與其線粒體基因密切相關(guān)。目前比較常見(jiàn)的不育類(lèi)型主要有波里馬不育胞質(zhì)（Pol CMS）、蘿卜不育胞質(zhì)（Ogu CMS）和甘藍(lán)型油菜不育胞質(zhì)（Nap CMS）等。蕓薹屬中波里馬不育胞質(zhì)、蘿卜不育胞質(zhì)研究較多，二者利用比較廣泛[2～4]。研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的細(xì)胞質(zhì)雄性不育均與線粒體基因變異有關(guān)，其中起主要作用的是重要基因和未知片段重組形成的開(kāi)放讀碼框（ORF）。人們?cè)诜肿予b定方面對(duì)不育類(lèi)型進(jìn)行了研究，可以有效區(qū)分CMS類(lèi)型。張德雙等[5]利用orf138引物證實(shí)了所獲得的白菜CMS96胞質(zhì)不育系mtDNA的特異序列與Ogu CMS有高度同源，為Ogu CMS不育類(lèi)型。王春國(guó)等[6]通過(guò)設(shè)計(jì)orf138特異引物對(duì)花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，證明所用細(xì)胞質(zhì)不育材料為Ogu CMS不育類(lèi)型。

本試驗(yàn)通過(guò)提取甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料PM和QM mtDNA，設(shè)計(jì)orf138特異引物對(duì)其mtDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)而通過(guò)同源比對(duì)來(lái)鑒定PM和QM雄性不育的類(lèi)型，證明2個(gè)雄性不育材料的分子類(lèi)型，為今后研究甘藍(lán)雄性不育的分子機(jī)制提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2個(gè)甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)不育品系PM和QM。

1.2 試驗(yàn)方法

①黃化苗的培育 首先取甘藍(lán)種子1 g左右，用清水沖洗干凈，浸泡30 min，然后放置在無(wú)菌瓶中，于28℃暗培養(yǎng) 7～10 d（定期更換補(bǔ)充燒杯內(nèi)水源），長(zhǎng)出的黃化幼苗即可作為試驗(yàn)材料。

②mtDNA提取試劑 DNaseⅠ、RNase A、蛋白酶K均為T(mén)akara產(chǎn)品，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。a.勻漿緩沖液。0.4 mol/L甘露醇；50 mmol/L Tris-HCl，pH值 7.5；20 mmol/L EDTA-Na2；1.0 mol/L NaCl；0.2%BSA；0.1%半胱氨酸；1%PVP（BSA、半胱氨酸和PVP在試驗(yàn)前加）。

b.酶解緩沖液。0.4 mol/L甘露醇；50 mmol/L Tris-HCl，pH 值 7.5；10 mmol/L MgCl2；0.1%BSA（試驗(yàn)前加）。

c.Shelf緩沖液。0.5 mmol/L甘露醇；10 mmol/L Tris-HCl，pH 值 7.5；20 mmol/L EDTA-Na2。

d.裂解緩沖液。50 mmol/L Tris-HCl，pH 值 8.0；20 mmol/L EDTA-Na2；5%SDS；0.1 mol/L NaCl；0.01%β-巰基乙醇。

e.EDTA溶液。0.5 mol/L，pH值8.0。

f.DNaseⅠ溶液。1 U/mL。

g.蛋白酶K溶液。20 mg/mL。

h.乙酸鈉溶液。3 mol/L。

③線粒體提取 a.稱(chēng)取20 g結(jié)球甘藍(lán)黃化苗，在冰水中沖洗10 min后擦干，放入盛有100 mL勻漿緩沖液的燒杯中，置于4℃冰箱15～30 min（黑暗條件下）。

b.在勻漿機(jī)中高速勻漿，每次約15 s，重復(fù)5次。用8層紗布過(guò)濾勻漿液于預(yù)冷的50 mL離心管中，濾液于1 000 r/min離心10 min。

c.取上清液2 000 r/min離心10 min后，再取上清液于2 000 r/min離心15 min，重復(fù)1次，棄上清液，得到粗線粒體沉淀。

d.向每管沉淀中加入20 mL預(yù)冷的勻漿緩沖液，懸浮沉淀，于20 000 r/min離心15 min，充分棄掉上清液，得粗線粒體沉淀。

e.在粗線粒體沉淀中加入1 mL預(yù)冷的酶解緩沖液，懸浮沉淀于2個(gè)離心管中，后每管加入5 mL酶解緩沖液，15 mL DNaseⅠ，混勻后室溫放置，每5 min輕輕搖動(dòng)懸浮液1次，30 min后放入冰浴中1 h。之后每管加入600 μL EDTA溶液，混勻后室溫靜止10 min終止DNaseⅠ消化反應(yīng)。

f.將上述溶液小心鋪于Shelf緩沖液上（每管25 mL），于18 000 r/min離心20 min后收集沉淀。再用6 mL酶解緩沖液重新懸浮線粒體沉淀，并將懸浮液緩慢鋪于Shelf緩沖液上（每管15 mL），于18 000 r/min離心20 min，所得沉淀即為純化的線粒體。

④mtDNA提取方法 a.向每管沉淀中加入6 mL酶解緩沖液，輕輕混勻后，分裝到6個(gè)2 mL離心管中，于18 000 r/min離心15 min后棄上清液。

b.每管沉淀中加入0.9 mL裂解緩沖液，5 μL蛋白酶K，用槍頭吸打沉淀，使沉淀在裂解緩沖液中混勻，65℃水浴1 h，同時(shí)輕搖。

c.向裂解液中加入100 mL NaAc，然后加入等體積的苯酚+氯仿+異戊醇混合液（三者體積比25∶24∶1），緩慢混勻 10 min 以上，12 000 r/min 離心10 min抽提DNA，收集上清液，并重復(fù)抽提一次。

d.向上清液中加入 RNaseA 酶（10 mL/mL），37℃條件下反應(yīng)1 h，同時(shí)輕搖。

e.加入等體積的苯酚+氯仿+異戊醇混合液（三者 體 積 比 25∶24∶1），緩慢混勻 10 min 以上 ，于12 000 r/min離心10 min抽提DNA，收集上清液，并重復(fù)抽提一次。

f.向上清液中加入1/10體積的NaAc和2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，-20℃過(guò)夜沉淀，于18 000 r/min離心20 min，收集沉淀。

g.沉淀用70%乙醇洗滌3次，置超凈工作臺(tái)上吹干，溶于30 mL超純水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

⑤引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)orf224和orf138基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，委托蘇州金唯智公司進(jìn)行引物的合成（表1）。

⑥PCR擴(kuò)增 20 mL反應(yīng)體系中含1×PCR緩沖液、2.0 mmol MgCl2、2.0 mmol dNTP、1 μL DNA、2條引物各 0.5 μmol、1 U Taq酶，用 ddH2O補(bǔ)足。PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性 2 min；94℃變性 30 s，53℃（根據(jù)Tm設(shè)定）退火1 min，72℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；72℃保溫延伸5 min，4℃下保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)束后在紫外燈下觀察照相。

⑦特異條帶回收、純化及mtDNA序列分析 按照大連寶生物有限公司試劑盒的使用說(shuō)明方法回收純化，回收純化后的mtDNA于4℃貯存?zhèn)溆谩＿B接體系為 5 μL，0.5 μL pGEM-T 載體，0.5 μL 連接酶，2.5 μL 2×連接酶，1.5 μL PCR 產(chǎn)物。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，EcoRⅠ酶切、電泳檢測(cè)后委托蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)不育材料mtDNA檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)測(cè)定，提取的mtDNA的OD260/OD280值在1.6～1.8，OD260/OD230>2.0，0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，電泳條帶清晰（圖1），表明所提取的mtDNA質(zhì)量滿足進(jìn)行后面試驗(yàn)的要求。

表1 基于orf224和orf138基因設(shè)計(jì)的特異引物

2.2 orf138和orf224特異引物的PCR結(jié)果

用設(shè)計(jì)的orf138、orf224特異引物對(duì)2個(gè)甘藍(lán)供試材料的mtDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用orf138設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)2個(gè)甘藍(lán)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2個(gè)不育系PM、QM均擴(kuò)增出350 bp左右的條帶（圖2）；而用設(shè)計(jì)的orf224特異引物對(duì)2個(gè)不育材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不育系均沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)生條帶。

圖1 甘藍(lán)mtDNA的0.8%瓊脂凝膠電泳圖譜

圖2 orf138引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜

2．3 序列的同源性比較

利用pGEM-T載體連接，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，EcoRⅠ酶切、電泳檢測(cè)，條帶清晰明顯（圖3），故可以進(jìn)行測(cè)序，選用orf138特異引物擴(kuò)增出條帶的供試材料克隆進(jìn)行測(cè)序。

利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，這2個(gè)序列都與已知的蘿卜Ogura雄性不育線粒體基因組的部分序列存在很高的相似性，但是有個(gè)別位點(diǎn)存在差異，2個(gè)片段與Ogu型胞質(zhì)不育蘿卜線粒體開(kāi)放讀碼框orf138同源性均為92.55%（圖4），長(zhǎng)度為297 bp，證明2個(gè)來(lái)源不同的甘藍(lán)雄性不育供試材料均屬于蘿卜細(xì)胞質(zhì)不育類(lèi)型Ogu CMS。

圖3 質(zhì)粒EcoRⅠ酶切電泳圖

圖4 2個(gè)甘藍(lán)不育系與Ogu CMS蘿卜orf138核苷酸序列同源性比較

3 討論與結(jié)論

在十字花科作物的細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多特異性存在于不育系的開(kāi)放閱讀框中，如不育系甜菜的orf239、蘿卜的orf138、白菜的orf222、油菜的orf224及芥菜的orf220等[7]。Ogu CMS是于1968年在日本鹿兒島一個(gè)蘿卜品種留種田中發(fā)現(xiàn)的一種新型胞質(zhì)不育系，是目前國(guó)內(nèi)外十字花科蕓薹屬中應(yīng)用較為廣泛的一種不育類(lèi)型。李建斌等[8]利用多個(gè)結(jié)球甘藍(lán)胞質(zhì)雄性不育材料，通過(guò)對(duì)orf138和orf222基因進(jìn)行PCR，結(jié)果顯示其中的59個(gè)材料含有orf138。張艷等[9]利用Ogu CMS的orf138特異引物及Nap CMS和Pol CMS的共同引物，在15份甘藍(lán)CMS材料中鑒定出了有14份是Ogu CMS。本文通過(guò)已知引物設(shè)計(jì)了2組特異引物，發(fā)現(xiàn)orf138特異引物在甘藍(lán)雄性不育材料都有擴(kuò)增產(chǎn)物，orf224特異引物在甘藍(lán)雄性不育材料沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)來(lái)源不同的甘藍(lán)雄性不育材料與Ogura型胞質(zhì)不育蘿卜線粒體開(kāi)放閱讀框orf138的同源性高達(dá)92.55%，表明這2個(gè)甘藍(lán)雄性不育材料均屬于Ogura胞質(zhì)不育類(lèi)型，為今后甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系在育種中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，并為實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)育種提供了分子依據(jù)。

鑒別雄性不育系的不育類(lèi)型有助于掌握其遺傳規(guī)律和遺傳機(jī)理，為人工合成保持系或者合理利用雄性不育系提供理論基礎(chǔ)。本文通過(guò)利用PCR快速鑒定了2個(gè)甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料，證明了供試材料的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類(lèi)型為Ogura胞質(zhì)不育類(lèi)型，為進(jìn)一步有效地開(kāi)展細(xì)胞質(zhì)雄性不育系在育種中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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