SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析酸水解玉米蛋白粉中的揮發(fā)性物質(zhì)

楊雪娟，李永歌,*，許麗娟，劉會(huì)雙

（1.保定味群食品科技股份有限公司，河北 保定 071000；2.保定出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 保定 071000）

SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析酸水解玉米蛋白粉中的揮發(fā)性物質(zhì)

楊雪娟1，李永歌1,*，許麗娟2，劉會(huì)雙2

（1.保定味群食品科技股份有限公司，河北 保定 071000；2.保定出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 保定 071000）

采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)酸水解玉米蛋白粉中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，并優(yōu)化固相微萃取條件。結(jié)果表明，最優(yōu)固相微萃取條件為：65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯萃取頭、2.0 g酸水解玉米蛋白粉、5 mL純水、2.0 g氯化鈉置于萃取瓶中，萃取溫度60 ℃、萃取時(shí)間30 min。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定，共分離出50 種化合物，其中醛類、芳香族類、含硫類、有機(jī)酸類、吡嗪類、呋喃類、吡咯類對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

酸水解玉米蛋白粉；固相微萃取；揮發(fā)性物質(zhì)

酸水解植物蛋白粉（hydrolyzed vegetable protein，HVP）是以含食用植物蛋白的脫脂豆粕、花生粕、小麥蛋白或玉米蛋白為原料，經(jīng)鹽酸法水解，堿中和后噴霧制成[1]。HVP是一種在全世界廣泛應(yīng)用的食品風(fēng)味物質(zhì)[2]，在醫(yī)療、化工、食品等領(lǐng)域都有著廣泛的用途，特別是在調(diào)味品行業(yè)，以往主要用于醬油和醬腌菜生產(chǎn)，近年來(lái)，隨著食品工業(yè)的發(fā)展，特別是在方便面、雞精、雞粉、休閑食品、香精香料等食品加工業(yè)中，HVP及其產(chǎn)品需求量逐日增加，成為人們?nèi)粘Ｊ秤玫恼{(diào)味佳品[3]。但現(xiàn)在對(duì)于HVP的研究主要集中在工藝改進(jìn)和產(chǎn)品應(yīng)用方面，對(duì)于其中的揮發(fā)性物質(zhì)研究報(bào)道很少。

已有的文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)HVP調(diào)味液以及其參與的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中揮發(fā)性物質(zhì)研究多是采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析，而對(duì)HVP中的揮發(fā)性物質(zhì)研究很少，其采用的前處理手段有吹掃捕集、固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）、液液萃取、直接溶劑萃取、同時(shí)蒸餾萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）[4-8]等。

SPME由于無(wú)需有機(jī)試劑，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，分析速度快、靈敏度高，已經(jīng)成為復(fù)雜基體中痕量組分分析的主流提取分析方法[9]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇酸水解玉米蛋白粉作為研究對(duì)象，采用SPME與GC-MS結(jié)合，對(duì)HVP中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定分析，并優(yōu)化SPME條件，為進(jìn)一步研究HVP中揮發(fā)性物質(zhì)的種類及含量提供理論和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HVP 保定味群食品科技股份有限公司；QP-2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；固相微萃取頭65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯（polydimethylsiloxane/ divinylbenzene，PDMS/DVB）涂層 美國(guó)Supelco公司；DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)安捷倫公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 陽(yáng)光科技儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 SPME針老化

SPME針在使用前需進(jìn)行老化處理，以消除雜質(zhì)的影響。老化條件為：將SPME針插入GC-MS進(jìn)樣口，250 ℃條件下老化3 min。若是第一次使用，則需將老化時(shí)間延長(zhǎng)至30 min。

1.2.1.2 樣品制備

稱取2.0 g（精確至0.001 g）的粉體樣品，加入5 mL純水和2.0 g（精確至0.001 g）的氯化鈉，置于15 mL萃取瓶中，搖勻后插入SPME針，在水浴溫度60℃條件下萃取30 min后，將SPME針插入GC-MS進(jìn)樣口，250℃條件下解吸10 min。

1.2.2 優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 單因素試驗(yàn)

選取不同因素分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量為主要考察指標(biāo)，確定樣品量（1.0、2.0、5.0、10.0 g）、氯化鈉添加量（1.0、2.0、3.0、5.0 g）、萃取溫度（30、45、60、70 ℃）、萃取時(shí)間（10、20、30、40 min）。考察其中單一因素條件時(shí)，固定其他因素條件不變。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選取樣品量（A）、氯化鈉添加量（B）、萃取溫度（C）、萃取時(shí)間（D）4 個(gè)因素，每個(gè)因素選取3 個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行最優(yōu)條件的篩選，結(jié)果以檢測(cè)出的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。

1.2.3 色譜和質(zhì)譜分析條件

DB-5MS色譜柱；載氣He；流速1 mL/min；升溫程序：起始溫度40℃，保持1 min，然后以5℃/min速率升到200℃，保持15 min，最后以10℃/min升至250℃，保持7 min。汽化室溫度250℃；分流進(jìn)樣，分流比20∶1；電子電離源；電子能量70 eV；發(fā)射電流200 μA；離子源溫度200℃；接口溫度250℃；質(zhì)量掃描范圍29～450 u；全掃描模式；掃描速率0.2 s/scan[10]。

1.2.4 風(fēng)味物質(zhì)化合物鑒定及相對(duì)含量確定

利用NIST 05譜庫(kù)檢索，對(duì)相似度不低于70%的化合物進(jìn)行定性鑒定，按照峰面積歸一化法計(jì)算化合物相對(duì)含量[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 樣品量的確定

圖1 樣品量對(duì)萃取結(jié)果的影響Fig.1 Effect of sample amount on the extraction efficiency

由圖1可知，隨著樣品量的不斷增加，萃取得到的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量逐漸增多，但當(dāng)樣品量超過(guò)2.0 g時(shí)，萃取效果增長(zhǎng)基本平穩(wěn)，且樣品量過(guò)大容易引起峰值飽和現(xiàn)象，故最終選取樣品量為2.0 g最佳。

2.1.2 氯化鈉添加量的確定

圖2 氯化鈉添加量對(duì)萃取效果的影響Fig.2 Effect of salt concentration on the extraction efficiency

由圖2可知，氯化鈉添加量為2.0 g時(shí)，萃取效果最佳，故選取氯化鈉添加量為2.0 g。加入氯化鈉后，可提高溶液中的離子強(qiáng)度，進(jìn)而提高萃取靈敏度。

圖3 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency

2.1.3 萃取溫度的確定由圖3可知，當(dāng)萃取溫度超過(guò)60 ℃時(shí)，提取的風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量變化平緩，故選取60 ℃作為最優(yōu)萃取溫度。

2.1.4 萃取時(shí)間的確定

圖4 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction efficiency

由圖4可知，萃取時(shí)間超過(guò)30 min后，對(duì)萃取效果影響不明顯，故選取30 min作為最優(yōu)萃取時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table1 Orthogonal array design and results

由表1極差分析可知，對(duì)提取出的揮發(fā)性物質(zhì)種類影響較大的是B（氯化鈉添加量），加氯化鈉的作用是促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā)，從而利于萃取針的吸附；其次是A（樣品量）、C（萃取溫度），而D（萃取時(shí)間）對(duì)其影響較小，即影響主次順序?yàn)椋築＞A＞C＞D。

頂空SPME的最優(yōu)條件為：A2B2C1D1或A2B2C1D2，而因素D（萃取時(shí)間）對(duì)結(jié)果的影響較小，且考慮長(zhǎng)時(shí)間萃取會(huì)降低萃取針的使用壽命，故采用A2B2C1D2為最優(yōu)條件，即：準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品（精確至0.001 g），加入5 mL純水和2.0 g（精確至0.001 g）氯化鈉，置于15 mL萃取瓶中，搖勻后插入萃取針進(jìn)行萃取，保持60℃恒溫，萃取30 min后，250℃解吸10 min。

2.3 HVP中風(fēng)味物質(zhì)的分離鑒定及分析

采取SPME最優(yōu)方案對(duì)HVP樣品中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定及分析，其GC-MS總離子流圖見(jiàn)圖5。其中各個(gè)組分經(jīng)NIST 05譜庫(kù)檢索及資料分析后所得揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)名稱及相對(duì)含量見(jiàn)表2。

圖5 HVP的GC-MS總離子流圖Fig.5 GC-MS Total ion current chromatogram of HVP

表2 HVP中分離鑒定出的風(fēng)味化合物Table2 Isolated and identified flavor compounds from HVP

續(xù)表2

由表2和圖5可知，采用SPME技術(shù)提取樣品的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，共鑒定出12 類50 種化合物，包括醛類、芳香族類、酸類、酮類、酯類、烯類、醇類、烷類、胺類、呋喃、吡嗪和其他類化合物。

有文獻(xiàn)[12]報(bào)道醛類化合物閾值很低，在HVP粉中共檢測(cè)出醛類物質(zhì)共有6 種，占全部風(fēng)味物質(zhì)的比例超過(guò)了40%，對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味貢獻(xiàn)很大。苯乙醛、苯甲醛等芳香醛可能來(lái)自氨基酸的Strecker降解，具有類風(fēng)信子、杏仁的香氣[13]；壬醛可能來(lái)自脂肪酸的氧化降解，是雞湯和雞肉香精的特征香味化合物[14]。

芳香族化合物和雜環(huán)類化合物（吡嗪、吡咯等）一般認(rèn)為閾值較低，對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。其中雜環(huán)類化合物一般認(rèn)為來(lái)自美拉德反應(yīng)[15]，這與HVP的生產(chǎn)工藝有關(guān)，高溫促成了這些化合物的形成。含硫化合物則可能來(lái)自含硫氨基酸的降解，如：甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸，通過(guò)氨基酸Strecker降解反應(yīng)生成硫醇，再進(jìn)一步氧化形成硫醚等硫化物[16]；二甲基三硫化物被認(rèn)為是蛋氨酸的降解產(chǎn)物，也是雞肉關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)之一[17]。因此HVP的特征物質(zhì)對(duì)雞肉的特征香味有增強(qiáng)作用，被廣泛應(yīng)用于雞肉風(fēng)味產(chǎn)品尤其是雞肉香精的生產(chǎn)過(guò)程中。

揮發(fā)性有機(jī)酸既是呈味物質(zhì)又是呈香物質(zhì)，閾值較低，對(duì)風(fēng)味有較大影響。其中小分子的有機(jī)酸對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)更大：丁酸具有腐臭的氣味[18]；3-甲基丁酸具有刺激性酸敗味，高度稀釋后則有篤斯越橘樣的香味[19]；2-甲基丁酸呈刺鼻辛辣的羊乳干酪氣味，低濃度時(shí)呈愉快的水果香氣；己酸天然存在于杏、干酪、面包中，具有椰肉油氣味[20]；己酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、戊酸、4-氧代戊酸均是我國(guó)規(guī)定允許使用的食用香料[21]。

酮類化合物一般閾值較高，對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較小；本方法檢出的4 種酮類均為雜環(huán)化合物，是形成特征香氣物質(zhì)的風(fēng)味前體[22]，對(duì)HVP風(fēng)味的形成具有不可忽視的作用。本實(shí)驗(yàn)還檢出了醇類、烷烴類、酯類等直鏈化合物，一般閾值較高，對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)不大[23]。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)分析了SPME技術(shù)對(duì)HVP中揮發(fā)性物質(zhì)提取的最優(yōu)條件，即：準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確至0.001 g）HVP置于15 mL萃取瓶中，再加入5 mL純水和2.0 g（精確至0.001 g）氯化鈉，搖勻后插入萃取針進(jìn)行萃取，水浴鍋保持60℃恒溫，萃取30 min后，250℃解吸10 min。經(jīng)GC-MS分析，最優(yōu)條件下酸水解玉米蛋白粉中揮發(fā)性物質(zhì)共有12 類50 種，對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的化合物主要是醛類、吡嗪類、呋喃類、吡咯類、含硫化合物和芳香族化合物，其中特征風(fēng)味化合物主要有：苯乙醛、苯甲醛、壬醛、3-甲基硫代丙醛、2-乙酰基-5-甲基呋喃、2-乙基-6-甲基吡嗪、5,10-二乙氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-二吡咯[1,2-a;1’,2’-d]吡嗪、2,5-二氫-2,2-二甲基-5-（1-乙烯基）-3-（1-甲基乙基）-呋喃、N-（4-甲基-3-戊烯基）四氫吡咯、二甲基三硫化物、2,6-二甲氧基苯酚、2,4-二-叔-丁基-6-硝基苯酚、苯酚、丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、乙酰丙酸、己酸等化合物。

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Analysis of Volatile Compounds in Hydrolyzed Corn Protein Powder by Solid Phase Micro-Extraction and Gas Chromatography-Mass Spectrometry

YANG Xuejuan1, LI Yongge1,*, XU Lijuan2, LIU Huishuang2
(1. Baoding Way Chein Food Industrial Co. Ltd., Baoding 071000, China; 2. Baoding Entry -Exit Inspection and Quarantine Bureau, Baoding 071000, China)

The volatile substances in hydrolyzed corn protein powder were analyzed by using solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS), and the SPME conditions were optimized. The extraction and separation were achieved by using a 65 μm PDMS/DVB solid-phase micro-extraction fiber, putting 2.0 g of acid hydrolyzed corn protein powder, 5 mL of pure water and 2.0 g of NaCl in an extraction bottle, setting extraction temperature at 60 ℃, and extracting for 30 min. By using GC-MS to identify the volatile flavor substances in the sample, a total of 50 compounds were isolated and identified to be aldehydes, aromatic compounds, sulfur compounds, organic acids, pyrazine, furan and pyrrole, which largely contributedto the flavor.

hydrolyzed corn protein powder; solid phase micro-extraction; volatile compound

TS264.2

A

1002-6630（2015）04-0176-05

10.7506/spkx1002-6630-201504034

2014-06-16

楊雪娟（1987—），女，碩士，研究方向?yàn)槭称氛{(diào)味料新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。E-mail：yangxuejuanbiao@163.com

*通信作者：李永歌（1973—），女，碩士，研究方向?yàn)槭称氛{(diào)味料新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。E-mail：liyongge4128659@163.com