沉默信息調節因子2相關酶1及脂肪酸合成酶在非酒精性脂肪肝大鼠模型中的表達及意義*

史燕如，常艷，辛鵬，項琦，張美榮

（1.天津市南開醫院營養科，天津 300100；2.天津市疾病預防控制中心，天津 300171）

·論著·

沉默信息調節因子2相關酶1及脂肪酸合成酶在非酒精性脂肪肝大鼠模型中的表達及意義*

史燕如1，常艷1，辛鵬2，項琦1，張美榮1

（1.天津市南開醫院營養科，天津 300100；2.天津市疾病預防控制中心，天津 300171）

目的觀察高脂、高糖喂養對大鼠非酒精性脂肪肝（NAFLD）的影響，探討其沉默信息調節因子2相關酶1（Sirt1）及脂肪酸合成酶（FAS）的表達變化，進而揭示可能引起NAFLD發病的分子途徑。方法Wistar雄性大鼠分為正常組和模型組，分別飼以基礎飼料和高脂、高糖飼料。13周后處死，肝臟行蘇木精-伊紅（HE）染色和油紅O染色，檢測血清及肝勻漿總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）含量，應用實時逆轉錄聚合酶鏈反應（Real-time RT-PCR）和Western blot檢測大鼠肝組織FAS、Sirt1的mRNA和蛋白表達水平。結果模型組大鼠體重、能量利用率、血清及肝臟TC和TG明顯高于正常組。HE染色和油紅O染色觀察到模型組大鼠肝細胞脂肪明顯變性。模型組肝臟Sirt1 mRNA水平與正常組比較，差異無統計學意義，但蛋白水平明顯低于正常組；模型組肝臟中FAS mRNA和蛋白水平明顯低于正常組。結論高脂、高糖喂養能使大鼠形成NAFLD，增加血清及肝臟的脂肪濃度。Sirt1表達降低提示其與NAFLD的發生有關，而FAS表達降低與以往部分研究結果截然不同，還需要更深層次的研究。

非酒精性脂肪肝；沉默信息調節因子2相關酶1；脂肪酸合成酶

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是基因、環境、代謝應激等相關因素共同作用的結果，是以肝細胞脂肪堆積為主的臨床病理綜合征。西方國家NAFLD的患病率約為20%～30%，亞太地區接近12%～40%[1]。非酒精性脂肪肝的發生機制非常復雜，包括遺傳因素、胰島素抵抗、氧化應激等，其肝臟攝取和合成脂類的能力超過清除能力，即肝臟脂類的獲得與清除沒有達到平衡是重要的原因之一[2]。

脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）是一種多功能的復合酶，是合成脂肪酸的關鍵酶，與體內脂質代謝密切相關。高脂、高糖飲食中的脂質以脂肪酸的形式被肝臟攝取，使肝臟三酰甘油（Triglycerides，TG）合成增多，容易形成脂肪肝[3]。然而國內外對非酒精性脂肪肝形成中FAS表達改變的研究結果迥異[4-7]，還需深入研究。

沉默信息調節因子2相關酶1（silent information regulator 2/sirtuin1，Sirt1）是在哺乳動物細胞中發現的與酵母沉默信息調節因子Sir2同源性最高的同系物，是一類尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的脫乙酰基酶，與代謝綜合征的發生密切相關。Sirt1參與體內許多生理功能的調節，包括眾多基因轉錄、能量代謝以及細胞衰老過程的調節，尤其在糖和脂代謝中發揮重要作用[8]。目前，國內外關于非酒精性脂肪肝中Sirt1的表達也引起越來越多的重視[9-10]。本研究用高脂、高糖膳食復制大鼠非酒精性脂肪肝模型，并研究該模型動物中肝臟FAS和Sirt1的表達。

1 材料與方法

1.1實驗動物

清潔級Wistar雄性大鼠20只，初始體重（170± 10）g，購于上海西普爾-必凱實驗動物公司，分為正常組（基礎飼料）和模型組（高脂、高糖飼料）。基礎飼料由華中科技大學同濟醫學院實驗動物學部提供；高糖、高脂飼料由60%基礎飼料、17.5%豬油、8%蔗糖、10%雞蛋黃粉、4%酪蛋白、0.5%牛膽鹽配制而成。基礎飼料供能比為：蛋白質26.48%、脂肪10.19%、碳水化合物63.33%，共12.96 kJ/g。高脂高糖飼料供能比為：脂肪54.22%，蛋白質18.33%，碳水化合物27.45%（19.65%淀粉，7.8%蔗糖），共17.09 kJ/g。喂養時間為13周，期間每天觀察大鼠飲食、糞便，記錄每天進食量及每周體重。實驗結束后，每組取3只大鼠做肝臟病理檢測和油紅O染色，另外7只大鼠斷頭處死后分離血清行相關指標測定，肝臟取出后液氮速凍并置于-80℃冰箱冷凍保存待用于后續實驗。

1.2試劑

總膽固醇（total cholesterol，TC）、TG試劑盒購自北京中生北控生物科技公司，SYBR green-based實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒購自大連TaKaRa公司，Sirt1抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗購自英國Abcam公司，FAS抗體購自美國Cell Signaling公司，β-actin抗體和油紅O試劑購自美國Sigma公司。

1.3方法

1.3.1能量利用率計算由于基礎飼料和高脂、高糖飼料的能量密度不同，故將食物攝入量換算為能量攝入量，再按公式算出能量利用率。能量利用率（%）=體重增量（g）/同期熱能攝入量（kcal）×100。

1.3.2血清及肝臟TC、TG檢測血清TC、TG的測定嚴格按照相關試劑盒說明書進行操作。將肝臟與異丙醇1∶9勻漿，4℃靜置48 h，3 000 r/min離心15 min，取上清液進行肝臟TC、TG測定。

1.3.3肝組織蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）和油紅O染色動物過夜禁食12 h后，4%多聚甲醛灌注固定，取固定好的肝臟組織進行常規HE染色。對于油紅O染色，先配置油紅O飽和液，即0.5 g油紅O充分溶于100 ml異丙醇中，按飽和液與水3∶2的比例配制成染液。取肝臟組織行厚度為8μm的冷凍切片，染色20 min，蘇木素復染核25 s，1%鹽酸分化后用流水沖洗反藍，甘油明膠封片后鏡下拍照觀察。

1.3.4實時逆轉錄聚合酶鏈反應（real-time reverse transcription-polymerasechainreaction，Real-time RT-PCR）實驗使用Trizol提取肝臟總RNA，嚴格按照SYBR green-based qRT-PCR試劑盒說明書在ABI-7900HT機器上進行實驗。管家基因GADPH作內參，結果用2-ΔΔCt方法計算。引物設計如下：GADPH正向引物：5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3'，反向引物：5'-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3'；FAS正向引物：5'-GGACGGAGGTATCAA-3'，反向引物：5'-CGGAACCACTCACAC-3'；Sirt1正向引物：5'-TTC AGAACCACCAAAGCG-3'，反向引物：5'-CAGCAAG GCGAGCATAAA-3'。Real Time PCR反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，共40個循環，60℃繼續延伸30 s，增加一個熔解曲線。

1.3.5Western blot實驗將肝臟組織切成小塊用無線電免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液[1%Triton X-100，1%脫氧膽酸鹽，0.1%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate，SDS）]充分勻漿裂解提取總蛋白。上樣前每個樣本取等量蛋白與2×SDS樣品緩沖液混合，100℃孵育5 min，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。0.1%Tween-20和5%脫脂奶粉的封閉液中孵育過夜。次日在室溫下一抗孵育2 h，洗脫緩沖液洗滌3次后用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，洗膜后加增強化學發光法（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑在Western blot檢測系統下檢測條帶，用Quantity One 4.62軟件對條帶進行分析，以目的條帶和β-actin條帶灰度值的比值作為檢測結果。

1.4統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1一般情況、體重及能量利用率比較

喂養中、后期正常組大鼠靈活好動，皮毛光澤整潔，體重持續小幅增長；模型組大鼠行動遲緩，毛發雜亂，體重持續快速增長。喂養結束時，兩組大鼠體重比較差異有統計學意義。根據實驗期間動物體重增量及同期熱能攝入量算出能量利用率，結果表明，模型組大鼠能量利用率顯著高于正常組（P=0.000）。見圖1、2。

圖1 兩組大鼠體重變化

圖2 兩組大鼠的能量利用率

2.2血清和肝臟TC、TG含量

模型組大鼠血清及肝臟TC、TG水平顯著高于正常組（P＜0.05）。見附表。

附表兩組大鼠血清及肝臟TC、TG水平比較（n=7±s）

附表兩組大鼠血清及肝臟TC、TG水平比較（n=7±s）

組別血清肝臟TC/（mmol/L）TC/（μmol/g）TG/（μmol/g）正常組1.14±0.310.97±0.259.09±2.0112.18±4.97模型組1.57±0.311.39±0.3315.66±2.5525.07±5.31 t值-2.81-3.03-5.35-4.69 P值0.0160.0110.0000.001 TG/（mmol/L）

2.3兩組大鼠肝臟HE和油紅O染色

HE染色光鏡下顯示，正常組大鼠肝細胞排列緊密，細胞核位于細胞中央，核大而圓；模型組大鼠肝細胞排列疏松，肝細胞中出現很多大的脂滴（見圖3A）。肝臟做冷凍切片后進行油紅O染色，結果顯示，正常組大鼠肝臟未見中性脂肪沉積，模型組肝臟中可見較多較大的脂滴聚集（見圖3B）。

圖3 兩組大鼠肝臟HE和油紅O染色（×400）

2.4 肝臟的FAS、Sirt1 mRNA及蛋白的表達

Real-time RT-PCR和Western blot結果顯示，模型組大鼠肝臟中FAS mRNA和蛋白水平顯著低于正常組（P=0.015和0.008）；模型組大鼠肝臟Sirt1 mRNA水平與正常組比較，差異無統計學意義（P= 0.599），但蛋白水平明顯低于正常組（P=0.012）。見圖4、5。

圖4 兩組大鼠肝臟中FAS和Sirt1 mRNA水平

圖5 兩組大鼠肝臟中FAS和Sirt1的蛋白表達

3 討論

脂肪肝（fatty liver disease，FLD）是世界范圍內最常見的一種肝病，分為酒精性脂肪肝與非酒精性脂肪肝。后者的病因可分為營養性（肥胖）、代謝性（低脂蛋白血癥）、內分泌性（糖尿病、高脂血癥）等。隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，肥胖、高脂血癥和糖尿病已成為非酒精性脂肪肝的最主要病因。

目前認為NAFLD的發病與胰島素抵抗、脂質代謝異常、氧化應激及脂質過氧化等因素有關，其中脂質代謝異常被認為是NAFLD發病機制中最關鍵，也是最基礎的環節之一，但具體機制尚未闡明。脂肪肝如果長期得不到有效治療就可能發展成脂肪性肝炎，甚至是肝硬化、肝癌，但是目前脂肪肝治療尚無特效藥，所以脂肪肝重在預防。因此，對非酒精性脂肪肝形成機制進行研究，從而發現有效的預防措施非常重要。

本研究結果顯示，模型組大鼠的體重、能量利用率及血清脂質含量高于正常組，肝臟TC、TG的沉積也顯著高于正常水平。從肝臟HE和油紅O染色可以觀察到模型組大鼠肝臟嚴重脂肪變性，而正常組大鼠肝細胞形態正常，未見脂質沉積，說明高脂、高糖飲食造成大鼠肝臟脂質代謝異常。

脂肪酸合成酶是體內合成脂肪途徑中一個關鍵酶，其表達上升是對內源性脂肪酸合成和細胞增殖的適應。FAS表達活性增高的意義在于滿足細胞對能量需求和增殖條件下形成細胞膜脂質的需要[11-12]。作為成脂基因的FAS，隨著脂類物質攝入的增多，FAS的表達往往顯著升高。國內外很多研究表明，非酒精性脂肪肝大鼠的肝臟FAS在其他調控基因的作用下表達上調[4-5]，從而參與高脂飲食大鼠非酒精性脂肪肝形成。本研究在實驗設計時也將模型組FAS表達上升作為預期結果之一，但最后卻得出相反的結論，與王玉明[6]和曹瑞等[7]的結果類似。其研究發現高脂攝入顯著降低大鼠肝臟FAS mRNA及蛋白表達水平，認為肝臟脂質的蓄積并非由提高脂肪酸和TG合成相關酶活性引起，可能與脂肪酸β氧化活性降低有關。本研究認為，模型組大鼠肝臟FAS表達降低是機體對高脂、高糖飲食的適應性調節，提示肝臟脂質沉積可能不是通過FAS表達增多引起的，但尚需更深入的研究和更多的理論支持。

Sir基因家族（Sirt1-Sirt4）在酵母中首次被發現，Sirt1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙酰化酶，可促進脂肪動員，降低脂肪沉積，還有延緩衰老、抑制增殖、增加胰島素分泌等作用。SUN等[13]用棕櫚酸處理肝臟細胞使其產生胰島素抵抗后，Sirt1的表達隨之降低，而通過基因轉染使其高表達Sirt1后可改善細胞的胰島素抵抗狀態。龐婧等[14]用油酸干預肝細胞生長后發現，油酸可導致三酰甘油在肝臟中的蓄積和影響肝細胞的胰島素敏感性，而這些改變很可能是通過下調Sirt1來實現。袁媛等[15]研究發現，高脂組小鼠脂代謝異常且肝臟Sirt1蛋白表達水平下降，而Sirt1激活劑白藜蘆醇可改善肝臟的脂代謝功能，其機制可能與促進肝臟Sirt1表達有關。白藜蘆醇是一種Sirt1有效激活劑，可以用過刺激Sirt1的表達及影響其活性而發揮對機體的保護作用[16]。也有研究表明，白藜蘆醇能抑制非酒精性脂肪肝的形成[17]。本實驗證實NAFLD大鼠肝臟Sirt1蛋白低表達，提示抑制Sirt1表達可能使其不能發揮促進脂肪消耗及改善胰島素抵抗的作用，從而導致非酒精性脂肪肝的形成。但本研究僅僅探討非酒精性脂肪肝形成中Sirt1表達的變化，為以后進一步的研究奠定基礎。

綜上所述，非酒精性脂肪肝形成的機制極其復雜。高脂、高糖飲食旨在模擬現代人的不良飲食習慣，用其喂養能使大鼠形成非酒精性脂肪肝。Sirt1表達下降可能參與非酒精性脂肪肝的形成；而FAS表達的明顯降低與很多研究結果截然相反，這需要更深層次的研究。

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（申海菊 編輯）

Expression of silent information regulator 2/SIRTuin1 and fatty acid synthase in liver of rats with nonalcoholic fatty liver disease and its significance*

Yan-ru SHI1,Yan CHANG1,Peng XIN2,Qi XIANG1,Mei-rong ZHANG1
(1.Department of Nutriology,Nankai Hospital,Tianjin 300100,P.R.China;2.Tianjin Center for Disease Control and Prevention,Tianjin 300171,P.R.China)

【Objective】To investigate the alteration of silent information regulator 2/sirtuin1(SIRT1)and fatty acid synthase(FAS)in liver of rats under high fat/sucrose diet(HFS)so as to reveal the possible pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD).【Methods】Male Wistar rats were divided into control group and model group.The rats in the control group were fed with standard diet and the rats in the model group were fed with HFS.After 13 weeks,the livers were stained with HE and oil red O,the content of total cholesterol(TC)and triglycerides(TG)was detected in the serum and liver homogenate,the alteration of SIRT1 and FAS in the liver was determined by RT-PCR and Western blot.【Results】Compared with the control group,the body weight,energy efficiency and serum and liver TC and TG levels were significantly increased in the model group.Unlike the control group,the fatty degeneration of hepatocytes was obvious in the model group by HE and oil red O staining.Compared to the control group,the hepatic SIRT1 protein expression significantly decreased in the model group,but the level of SIRT1 mRNA had no significant difference. Unexpectedly,the hepatic FAS mRNA and protein expressions in the model group were markedly decreased compared with those in the control group.【Conclusions】HFS can induce NAFLD and increase the lipidconcentrations in serum and liver of rat.These data indicate that HFS may induce NAFLD through downregulation of SIRT1 expression,whereas the low expression of FAS is completely different from some previous studies which requires further research.

nonalcoholic fatty liver disease;silent information regulator 2/sirtuin1;fatty acid synthase

R151.3；R575.5

A

1005-8982（2015）32-0009-05

2015-04-13

中央高校基本科研業務費專項資金（No：2011TS054）

張美榮，E-mail：1913293506@qq.com；Tel：022-27435067