HPLC 法測定復方龍血竭膠囊中五種皂苷含量

徐士奎 羅艷秋 覃 安

1.云南省食品藥品檢驗所，云南 昆明 650011;2.云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500;3.云南財經(jīng)大學，云南 昆明 650504

復方龍血竭膠囊是由冰片、龍血竭、三七加工制成的純中藥制劑，具有活血化瘀、定痛止血、斂瘡生肌等功效，主要用于跌打損傷、瘀血作痛、氣血凝滯、外傷出血、膿瘡久不收口及冠心病、心絞痛、心肌梗塞、血瘀證等心腦血管疾病。現(xiàn)行質(zhì)量標準用三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1等三種對照品對其進行含量測定，檢測成本較高且操作繁瑣，為節(jié)約檢測成本和有效控制藥品質(zhì)量，本研究探索用三七總皂苷對照提取物作為對照物質(zhì)建立高效液相色譜方法，為復方龍血竭質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器、試藥與樣品

1.1 儀器 島津LC-20A 高效液相色譜儀(日本島津公司)，檢測器:SPD-20A (D2+W));紫外分光光度計(島津UV-2550);分析天平(Denver TB-215D，十萬分之一);分析天平(SartorIUS BS224S，萬分之一)

1.2 試藥 對照品為三七總皂苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，10870-201002，以三七皂苷R16.9%、人參皂苷Rg128.0%、人參皂苷Re 3.8%、人參皂苷Rb129.7%、人參皂苷Rd 7.3%計);方法學研究用復方龍血竭膠囊樣品均由云南云河藥業(yè)有限公司提供;乙腈由Merck 公司生產(chǎn)，色譜純;水為超純水;磷酸為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈為流動相A，0.1%磷酸為流動相B，按下表進行梯度洗脫。檢測波長為203nm。

表1 梯度洗脫方法

2.2 對照品貯備溶液的制備 精密稱取三七總皂苷對照品99.87mg，置25ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1ml含三七皂苷R10.27564mg、人參皂苷Rg11.11854mg、人參皂苷 Re 0.15180mg、人參皂苷 Rb11.18646mg、人參皂苷Rd 0.29162mg 的對照品溶液，作為儲備液。對照品HPLC 圖譜見圖1。

2.3 供試品溶液制備 取本品裝量差異項下的內(nèi)容物，研細，精密稱取約0.75g，置具塞錐形瓶中，精密加入水25ml，密塞，稱定重量，振搖30min，稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。樣品HPLC圖譜見圖2。

2.4 陰性供試品溶液制備 按處方量取缺三七的其余藥材模擬制劑工藝制備陰性樣品，由云南云河藥業(yè)有限公司制備。取陰性樣品0.75g 按2.3 項下供試品溶液制備方法制備陰性供試品溶液。陰性樣品HPLC 圖譜見圖3。

2.5 方法學考察［1］

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取儲備液加甲醇制成系列濃度的混合對照品溶液(見表2:標準品的配制濃度)，分別精密吸取10μl 注入液相色譜儀，測定峰面積。以對照品濃度X 為橫坐標，峰面積積分值Y 為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程如表3 所示。

表2 標準品的配制濃度 /mg/ml

表3 線性關(guān)系

研究結(jié)果表明5 種成分在各自線性范圍內(nèi)，濃度與峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5.2 儀器精密度實驗 取同一對照品溶液(三七皂苷R1濃度0.166mg/ml;人參皂苷Rg1濃度0.671mg/ml;人參皂苷Re 濃度0.0912mg/ml;人參皂苷Rb1濃度0.712mg/ml;人參皂苷Rd 濃度0.175mg/ml)，按照2.1 項下的液相色譜條件重復進樣6 次(n=6)，每次進樣10μl，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 峰面積的RSD 值分別為1.34%、1.43%、1.20%、1.39%、1.41%，均＜2%，表明儀器的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實驗 精密稱取復方龍血竭膠囊樣品細粉0.75g，按2.3 項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取10μl 分別在0、10、20、30、40、50h 后進樣，按照2.1 項下的色譜條件依法測定，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 的RSD 分別為1.27%、1.40%、1.19%、1.33%、1.39%，表明供試品溶液在50 小時內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.4 重復性實驗 精密稱取同一批次復方龍血竭膠囊樣品細粉6 份，按2.3 項下供試品溶液制備方法處理后進行含量測定，按照外標法計算各樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 的含量，RSD 值分別為0.34%、0.25%、0.80%、1.24%、0.79%，說明該方法重復性良好。

2.5.5 耐用性試驗 取樣品溶液，分別對不同品牌、不同規(guī)格的色譜柱及不同柱溫進行優(yōu)化測定，結(jié)果表明對被測成分色譜峰的分離度及測定結(jié)果無明顯影響。

2.5.6 回收率試驗 精密稱取含量已知的復方龍血竭膠囊細粉6 份，每份約0.375g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，分別精密加入三七總皂苷對照品適量，按2.3 項下供試品溶液制備方法及2.1 項下的色譜條件依法測定含量并計算回收率，三七皂苷R1平均回收率為101.042%，RSD=1.58%;人參皂苷Rg1平均回收率為100.39%，RSD=1.59%;人參皂苷Re 平均回收率為101.91%，RSD=1.02%;人參皂苷Rb1平均回收率為100.71%，RSD=1.58%;人參皂苷Rd 平均回收率為99.99%，RSD=1.29%，表明該方法的回收率良好，結(jié)果分別見表4、表5、表6、表7、表8。

表4 三七皂苷R1 回收率結(jié)果

表5 人參皂苷Rg1回收率結(jié)果

表6 人參皂苷Re 回收率結(jié)果

表7 人參皂苷Rb1回收率結(jié)果

表8 人參皂苷Rd 回收率結(jié)果

2.6 樣品測定 分別稱取三個不同批次復方龍血竭膠囊樣品照上述色譜條件測定，結(jié)果見表6:樣品測定結(jié)果。

表9 樣品測定結(jié)果 /mg/g

3 結(jié)果與討論

本實驗用三七總皂苷對照提取物作為對照組，采取HPLC 法同時測定復方龍血竭膠囊中三七皂苷R1、人生皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 5個成分的含量，該方法分離度好、靈敏度高且穩(wěn)定性好，快速、簡便，同時可大大減少檢測成本，不失為藥品質(zhì)量控制好的方法和思路。

藥物療效的發(fā)揮基于其化學物質(zhì)基礎(chǔ)，化學成分如何表征是其質(zhì)量評價的關(guān)鍵問題。基于單個化學成分的表征逐漸被認識到違背中國傳統(tǒng)醫(yī)藥學整體理念和思維體系，無法揭示物質(zhì)基礎(chǔ)-化學成分群的整體性和復雜性，而整體質(zhì)量控制的思路越來越被廣泛接收［2］，如何開發(fā)廉價、快速的化學表征技術(shù)方法是藥品質(zhì)量控制研究的重要內(nèi)容。

［1］.國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄130-131.

［2］.賀福元，鄧凱文，石繼連，等.中藥有效成分群組方技術(shù)研究若干基礎(chǔ)瓶頸問題及數(shù)理特征化思路的提出［J］.中藥材，2009，32 (1):1-6.