HPLC 法測定乙肝寧顆粒中二苯乙烯苷含量

尹思泳 陳鐘揚 梁華倫 黎 奔

廣東省中醫院，廣東 廣州 510120

何首烏為常用中藥材，在醫療和保健中使用廣泛，具有補肝腎，益精血，烏須發，強筋骨，化濁降脂功效，是中醫補肝腎的主要藥物之一［1］。2014年7月，國家食品藥品監督管理局通過中央電視臺等新聞媒體發布國家藥品不良反應病例報告數據庫陸續收到口服何首烏及其成方制劑導致肝損傷的病例報告，經對相關病例進行分析并結合有關文獻報道綜合評價，認為口服何首烏及其成方制劑與肝損傷發生有一定相關性，指出口服何首烏及其成方制劑引起的肝損傷多呈可逆性，停藥或對癥治療后，預后多較好。但是，超劑量、長期連續用藥等可能增加其風險［2］。乙肝寧顆粒屬于國家中藥保護品種，由黃芪、丹參、何首烏、茵陳、川楝子等13 味中藥組成，具有補氣健脾、活血化瘀、清熱解毒等功效，臨床用于治療急慢性肝炎［3］。方中何首烏的主要有效成分是二苯乙烯苷和結合蒽醌［1］，然而藥典質量標準中含量測定項僅有黃芪的黃芪甲苷和白芍的芍藥苷［1］，而無何首烏的有效成分二苯乙烯苷含量的測定。目前，有不少文獻報道了對其他成分含量分析的報道［3～4］，但很少有對何首烏有效成分測定的報道。為此，本研究采用HPLC 法測定乙肝寧顆粒中二苯乙烯苷的含量，對保證其臨床用藥安全，減少或杜絕藥源性肝病具有積極的意義，同時為該藥的全面質量控制提供參考依據。

1 儀器和試藥

實驗儀器:美國安捷倫1200 液相色譜儀(帶DAD 檢測器和自動進樣器);試藥:乙肝寧顆粒 (201401571，201401581 和201401591 三批，湖南某藥業股份有限公司，購自老百姓大藥房);二苯乙烯苷對照品(批號為110844-200908，購自中檢所);甲醇購自默克公司，色譜純，其他試劑為分析純，去離子水為實驗室自制。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 提取方法的選擇 超聲法:取乙肝寧顆粒(批號201401571)適量，約10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50% 乙醇50ml，稱定重量，超聲處理 (功率120W，頻率40kHz)30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，濾過，作為供試品溶液。

回流法:取供試品(批號201401571)，按超聲法操作，將“超聲30min”改為“回流30min”，其余同超聲法制備。

分別取上述兩種溶液10μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結果如下(見表1)。

表1 不同提取方法的試驗結果 (n=3)

從表1 可以看出，采用超聲法測定結果高于回流法。

2.1.2 提取溶劑的選擇 為了獲得最優提取溶劑，本實驗根據二苯乙烯苷的溶解特性，分別采用水、稀乙醇(50.0%)以及甲醇作為溶劑進行提取。取乙肝寧顆粒(批號201401571)，照2.1.1 法中超聲法，分別用水、稀乙醇(50.0%)、甲醇進行提取制備供試品溶液，分別測定樣品中二苯乙烯苷的含量。結果見表2。

表2 不同溶劑試驗結果 (n=3)

從表2 可以看出稀乙醇的提取效率高于甲醇、水。這可能是由于乙肝寧顆粒在水溶液的環境中溶化性較好，在溶解于水中后，二苯乙烯苷再分散于稀乙醇所致。

2.1.3 提取時間的選擇 為了獲得最優提取時間，取乙肝寧顆粒(批號201401571)3 份，以甲醇為提取溶劑，按超聲法，分別超聲處理15min，30min，60min，制成供試品溶液，分別測定二苯乙烯苷的含量。結果見表3。

表3 提取時間對二苯乙烯苷含量的影響 (n=3)

從表3 可以看出，隨著超聲時間的延長，樣品溶液中的二苯乙烯苷濃度增加，到30min 左右達到峰值，隨后基本穩定?？赡茉蚴浅?5min 時樣品中二苯乙烯苷提取不完全，在超聲30min 到達峰值后已經提取完全。因此選擇30min 作為本品提取時間。

綜上，乙肝寧顆粒中二苯乙烯苷的最佳提取方法為:取本品約10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率50kHz)30min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，濾過，即得。

2.2 對照品溶液的制備 取經二苯乙烯苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml 約含5mg 的溶液，其他濃度的對照溶液采用稀釋法稀釋制備，各濃度對照溶液冷藏，備用，整個過程避光操作。

2.3 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水(25∶75)為流動相，檢測波長為320nm，流速為1.0ml/min，柱溫35℃，進樣量10μl，以外標標準曲線法定量。

2.4 方法專屬性 精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10μl，注入HPLC，記錄色譜圖，由色譜圖提示，在對照品色譜相應的位置上，供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰，空白溶劑(流動相)在此峰位置無吸收，對本品中二苯乙烯苷含量測定沒有干擾，方法專屬性良好。

2.5 標準曲線的繪制 精密量取濃度約為5mg/ml 的二苯乙烯苷對照品溶液1000、200、20 和10μl 至10ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列梯度溶液。分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，按含量測定方法測定，記錄色譜圖。以對照品的濃度(mg/ml)為橫坐標(x)，測得的峰面積為縱坐標(y)，繪制標準曲線。得回歸方程:y=268.7x-16.86，r=1。結果表明，二苯乙烯苷對照品濃度在0.005～5mg/ml 之間與其峰面積呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗 精密吸取濃度為0.1mg/ml 的二苯乙烯苷對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，重復連續進樣6 次，測定二苯乙烯苷峰面積，此時，二苯乙烯苷峰面積的RSD=0.12%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗 精密量取同一二苯乙烯苷對照品溶液，分別在0、8、16 和24h 按上述色譜條件注入液相色譜儀，測定二苯乙烯苷峰面積，此時二苯乙烯苷峰面積的RSD=0.68%，表明二苯乙烯苷對照品溶液在此條件下穩定性良好。

2.8 重復性 取同一批供試品(批號201401571)6 份，參照上述提取方法，按含量測定方法測定，記錄峰面積，計算含量，測得該批號乙肝寧顆粒中二苯乙烯苷的含量為0.056mg/g，RSD=0.93% (n=6)，表明該方法重復性良好。

2.9 回收率測定 取同一批已知含量(批號201401571)的供試品6 份，按照樣品含量的100%將二苯乙烯苷對照品溶液加入到樣品中，依上述最優提取條件進行提取，制備回收溶液，注入高效液相色譜儀，每份重復進樣2 次，共12 次，記錄色譜圖，計算回收率。結果見表4。

表4 回收率試驗結果 (n=2)

2.10 樣品測定 實測樣品3個，每個2 份，共計6 份，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，用標準曲線法計算二苯乙烯苷含量。結果見表5

表5 樣品測試結果表

5 討論

乙肝寧顆粒屬于國家中藥保護品種，也是補氣健脾、活血化瘀、清熱解毒的常用藥物之一，在《中國藥典》2010 版未對其主要成分何首烏進行質量控制。筆者為建立何首烏中有效成分二苯乙烯苷的含量測定方法，在試驗過程中對提取方法、提取溶液、提取時間三個因素進行了考查，最終確定提取條件為采用稀乙醇(50%)為提取劑，用超聲萃取的方法提取乙肝寧顆粒中的二苯乙烯苷。建立了高效液相色譜法測定乙肝寧顆粒中二苯乙烯苷的含量的方法，結果表明二苯乙烯苷含量為0.005～5 mg/ml 之間呈良好的線性關系，專屬性強，回收率在96.79%～101.08%之間，且操作簡便、準確，重現性好，靈敏度高，陰性對照發現無干擾。本實驗為乙肝寧顆粒進一步的質量標準控制提供了技術支持。

［1］國家藥典委員會.中國藥典(一部) ［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:164.

［2］國家食品藥品監督管理局.藥品不良反應信息通報［B/OL］http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0051/102902.html，2014-7-26.

［3］張秋蓉，周濃，楊敏.HPLC 測定乙肝寧顆粒中川楝素［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16 (10):78-79.

［4］梁國華，羅秀偉.高效液相色譜法測定乙肝寧顆粒中芍藥苷含量［J］.中國藥業，2008，17 (1):29-30.