動物活體及人工皮膚組織輻射旁效應研究進展

吳文青，楊浩然綜述，聶莉莉審校

動物活體及人工皮膚組織輻射旁效應研究進展

吳文青*，楊浩然*綜述，聶莉莉審校

輻射旁效應（RIBE）可以被不同類型的電離輻射所誘發。在各種體外培養細胞模型和活體動物及人體中，均檢測到RIBE的存在。RIBE導致低劑量輻射的健康風險高于理論預期值，導致放射治療后照射區域外原發性（輻射誘導）“二次”癌癥的發生。相比于二維培養細胞模型，動物模型和人工構建皮膚組織模型中的RIBE更加接近人體內的復雜生長環境，傳遞表現出很大的不同。該研究主要對活體動物和人工構建皮膚組織的RIBE研究進展進行綜述，對于研究RIBE的傳遞和機制具有重要的意義。

輻射風險；輻射旁效應；活體動物和人工構建皮膚組織

輻射旁效應（radiation-induced bytander effect，RIBE）是輻射發生后，受輻射細胞釋放出損傷信號，導致未受輻射的細胞表現出類似的生物學現象。RIBE損傷因子的釋放和傳遞主要通過兩種方式：釋放可溶性信號分子［1-2］和細胞間隙連接（gap junction intercellular communication，GJIC）［3］介導的細胞間信號轉導。目前RIBE主要在二維尺度培養的細胞模型中進行，二維細胞模型作為一個單層、簡化的培養系統，細胞在其中的生理狀態與響應外界刺激能力均與體內立體、三維的狀態存在較大差異。已有的研究［4］表明，三維組織模型和動物模型中的旁效應傳遞與二維培養細胞模型有很大不同。因此發展組織水平甚至個體水平上RIBE研究顯得尤為重要。現就RIBE在這兩個模型上的研究進展綜述如下。

1 基于動物個體水平的旁效應研究

Brooks et al［5］首次用α粒子照射中國倉鼠肝臟的部分區域，發現肝臟組織所有細胞的染色體畸變率均顯著上升，所有細胞面臨染色體損傷的風險。此外，移植受照射雄性小鼠的骨髓細胞至未照射雌鼠體內，在雌鼠的造血干細胞后代中觀察到染色體不穩定性［6］。在經過意外輻射事件［7］或高劑量放射治療［8］的情況下，從患者的血漿中發現致染色體斷裂的活動。研究［9-10］顯示嚙齒類動物、魚類等均能觀察到RIBE。

1.1 嚙齒類動物在RIBE中的研究到目前為止，動物個體水平上的RIBE研究還不夠全面，主要采用的模式動物是小鼠和大鼠。

1.1.1 輻射肺部引起的旁效應研究 Khan et al［9］發現利用60Co γ射線20 Gy照射大鼠肺的一部分區域，誘發肺的其它未照射區域產生RIBE。照射30%或70%的肺，肺的未照射區域微核率顯著上升。未照射區域的DNA損傷能被超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽抑制，表明氧化性自由基（reactive oxygen species，ROS）和一氧化氮（nitric oxide，NO）誘導未照射區域的DNA損傷。SOD類似化合物Eukarion-189，能有效地通過抗炎癥作用保護照射和未照射肺的DNA損傷。Calveley et al［11］利用60Co γ射線18 Gy照射大鼠部分肺臟，在肺的未照射區，DNA損傷呈周期性變化，且與免疫功能改變相關。整個肺組織的白介素-1α、白介素-1、白介素-6、腫瘤壞死因子-α、轉化生長因子-β1 mRNA表達水平發生周期性改變和巨噬細胞顯著激活。由此表明，照射部分肺臟時引起的RIBE與ROS、NO和免疫功能變化等有關。

1.1.2 輻射皮膚引起的旁效應研究 Koturbash et al［12］用1 Gy X射線照射小鼠皮膚的部分區域，對比全身照射、半身照射小鼠的皮膚，6、96 h后檢測DNA雙鏈斷裂（double strand break，DSB），發現在96 h與對照小鼠比較未有顯著性變化，表明在照射后96 h，DNA損傷已得到完全修復；但在照射后6 h全身照射和半身照射的小鼠皮膚中均檢測到DSB顯著增加，其中半身輻射最顯著的區域是距離照射區大于0.7 cm的皮膚；研究中還發現半身照射小鼠在照射6、96 h后都能檢測到Rad51蛋白表達上調，這也從另一方面證明了在照射后的96 h半身照射小鼠的旁區皮膚組織一直在進行DNA損傷修復。照射后6、96 h，在未受照射的皮膚中發現參與轉錄沉默的DNA甲基轉移酶1、甲基CpG結合蛋白2、甲基CpG結合結構域蛋白2顯著增加，說明表觀遺傳學因素參與RIBE過程。

Mancuso et al［13］發現了旁效應在未照射的組織中誘導腫瘤的發生，研究采用的小鼠模型是Ptch1+／-，新生小鼠事先用環狀鉛護罩罩住頭部，X射線3 Gy照射小鼠后半部分皮膚；結果顯示，與未經過照射的小鼠比較，半身照射的小鼠形成神經管細胞瘤的概率增加了39%。經過GJIC抑制劑組織纖維蛋白溶酶原激活劑的處理，γ-H2AX（DSB的一種標記蛋白）的形成和細胞凋亡率顯著下降，表明GJIC參與到旁效應的傳遞中。雖然相同X射線處理不同類型的小鼠，在未受照射的部分組織均能檢測到短期的旁效應，但是其中只有部分雜合動物的腦部等有致癌性，說明檢測終點依賴于動物的基因型。這就解釋了在放射治療后為什么很多患者的未照射組織短期檢測終點呈現各種變化，而二次癌癥的發病率很低。

1.1.3 輻射腦部引起的旁效應研究 自從腦部腫瘤成為成年人最常見的癌癥后，腦部放射成為最常見的治療手段。研究表明腦部局部照射能導致表觀遺傳學的改變和調節遠距離組織如脾臟、睪丸、皮膚等的基因表達。Koturbash et al［14］用20 Gy X射線照射大鼠腦部，照射后24 h和7個月取脾臟，發現脾臟發生了顯著的表觀遺傳學變化，如DNA低甲基化、組蛋白甲基化和DNA甲基轉移酶水平改變、非編碼RNA分子（miRNAs）上調等。這些分子水平上的變化甚至能一直維持在照射后7個月。局部腦部照射對不同性別的小鼠均能引起不同程度的脾臟miRNAs變化，性別差異導致的變化可能與Dicer酶增加的時間點有關，這通過切除小鼠性腺后Dicer酶表達模式與完整小鼠相比有差異所證實。Jan et al［15］也用20 Gy X射線照射大鼠腦部，在未照射的生殖器官如睪丸組織發生明顯的DNA損傷和DNA甲基化的變化。Ilnytskyy et al［16］發現用0.5 Gy X射線照射小鼠腦部，除照射后6 h發生皮膚的甲基化改變，直至14 d脾臟都是低甲基化。通過以上研究顯示，對腦部進行照射，無論劑量大小都可引起部分組織如脾臟、睪丸、皮膚等旁效應的產生，導致DNA和染色體的損傷，甚至表觀遺傳學的改變。

1.1.4 骨髓移植系統中RIBE的研究 骨髓移植系統已被用來研究RIBE。Watson et al［6］用0.5 Gy252Cf中子照射雄性小鼠骨髓細胞與未照射骨髓細胞混合移植到雌性小鼠，隨后在13個月時間內，未照射的造血干細胞后代中發現遺傳不穩定性如染色體易位和缺失，在受體小鼠骨髓中也發現了顯著的染色體畸變。由此顯示RIBE也存在于造血系統中。

1.2 魚類在RIBE中的研究RIBE不僅在脊椎動物中被證明，在魚類中也有所發現。研究［10，17］表明用0.5 Gy X射線照射斑馬魚，將未照射的斑馬魚和照射的斑馬魚放在同一容器中2 h，未照射的斑馬魚體內細胞死亡增加。提取未照射斑馬魚的皮膚、鰓、脾臟、腎臟、鰭進行細胞培養，所獲培養基能使報告細胞HPV-G的克隆存活率顯著下降，其中鰓和鰭提取組的效應最為明顯。

Yum et al［18］也證明了斑馬魚的RIBE。8個α粒子照射的斑馬魚胚胎與8個未照射的斑馬魚胚胎在瓊脂糖平板上共培養，通過吖啶橙染色發現兩種胚胎中都觀察到細胞死亡信號明顯增加。此發現證明RIBE可在斑馬魚胚胎間產生。Choi et al［19］研究α粒子也證明了上述結論，并且此旁效應的產生與所用劑量無直接關系；此外，還證實釋放到水中的分子信號在RIBE中起到一定作用。

1.3 動物個體RIBE機制方面的研究目前研究［1，3］顯示體外RIBE機制研究主要是以下兩個方面：一是受照射細胞釋放信號分子如ROS、NO等對未受照射細胞發生作用；二是通過GJIC介導或傳導這一過程。研究［20］顯示部分動物個體內旁效應機制研究也主要通過以上兩個方面。照射小鼠部分肺臟能調節ROS、NO和炎癥因子的變化來誘導未照射肺的DNA損傷等［9］；照射小鼠部分皮膚能導致未照射皮膚發生DSB和DNA甲基化的變化，且GJIC在旁效應的傳遞中起著重要的作用［12-13］；Mancuso et al［21］研究長期輻射效應傳遞的機制，發現GJIC和其主要組成蛋白connexin43與小鼠潛在的致癌中樞神經系統的信號傳遞有關，GJIC在旁效應信號傳遞到未照射腦部的過程中到至關重要的作用。Mancuso et al［22］進一步用輻射敏感性小鼠模型研究GJIC和connexin43在RIBE中的作用，檢測未照射區域皮膚的終點如DNA損傷和細胞凋亡，說明GJIC在RIBE信號傳遞中的重要作用。相關研究［14-15］顯示，表觀遺傳學機制參與到輻射誘發的體內旁效應。照射小鼠或者大鼠腦部能通過中樞系統的傳遞導致脾臟發生表觀遺傳學的改變（如低甲基化、DNMT的變化等）［14］以及細胞增殖、凋亡和p53蛋白的變化［15］，也能導致睪丸和皮膚的DNA損傷和表觀遺傳學的變化［16］；照射斑馬魚的研究［10，17］顯示，被照射的斑馬魚能釋放分子到水中影響未照射斑馬魚的部分組織發生存活率下降等，而具體的有哪些分子則研究較少［18-19］。雖然輻射誘發動物個體旁效應研究已取得一定的進展，但其確切的機制尚不完全清楚。

2 人工構建皮膚組織模型中的旁效應研究

在動物個體上研究RIBE已取得相當多的成果，但是由于動物個體內部環境相對復雜，且有些實驗室還不具備動物飼養條件，機制方面的研究還不完善。為了更全面的研究旁效應，有些研究人員采用三維組織模型研究RIBE，最廣泛使用的是人工構建皮膚組織。在人工構建皮膚組織模型中，細胞間信號同樣可通過GJIC［3］和擴散的方式［23］傳導。

2.1 人工構建皮膚組織中的RIBE研究人工構建皮膚組織是指利用細胞生物學和工程學原理與技術將種子細胞、細胞外基質與適當的支架材料等相結合構建出的皮膚替代物。目前已有商品化的皮膚組織替代物如Apligraf、EpiDerm、EpiAirway、REF等。

Belyakov et al［24］首次運用體外人工構建的皮膚組織（EPI-200和EFT-300）來研究RIBE在組織水平上的傳導，利用微束裝置，僅照射皮膚組織中100 μm厚的層，檢測此層兩側不同距離處的遺傳損傷。結果表明，在該層外側1 mm以內區域的細胞中，凋亡和微核發生率顯著上升（分別為對照組的2.8、1.7倍），但隨著距離增大，呈下降趨勢。Sedelnikova et al［25］利用相同的研究模型，檢測到輻射片層40 μm組織中DSB的發生，受輻射層中DSB陽性細胞率在輻射30 min后達到峰值，而附近（未受照射）片層中DSB陽性細胞率于輻射后12～48 h達到峰值，48 h后到第7天都呈下降趨勢。由此表明照射人工構建皮膚組織，未照射區域的旁效應與距離照射區的遠近有關，且會發生凋亡和DSB等，DSB可在一段時間內被修復。

2.2 人工構建皮膚組織在RIBE機制研究中的應用由于組織具有更加復雜的生理結構，因此其內在機制也更為復雜［26-27］。研究已證實三維組織中GJIC、ROS、NO、轉化生長因子-β1等因子同樣參與了RIBE傳導。Kovalchuk et al［28］運用EpiAirway組織模型研究發現電離輻射誘導旁組織中miRNA的表達上調，進一步導致DNA低甲基化、周期改變及凋亡率增加。miR-17家族表達上調導致細胞周期和抑癌基因相關的腺病毒E2啟動子結合因子1和視網膜母細胞瘤基因1的水平下調，說明組織旁區的增殖發生變化；miR-29家族表達水平的上調導致DNA甲基轉移酶3a和髓細胞白血病基因1表達水平的下降，影響了DNA甲基化和細胞凋亡；miR-16表達水平的改變導致B細胞淋巴瘤／白血病-2水平的變化，表明細胞凋亡發生了變化。由此表明部分組織被照射后，NO、轉化生長因子-β1等信號分子的傳遞，導致旁組織的細胞凋亡、周期調控和表觀遺傳學都可能發生了變化。

3 結語

到目前為止，在體內研究RIBE的證據很有限，還需要進一步了解損傷信號是如何傳遞到旁細胞或旁組織，及如何引起大范圍有效的反應，從而評價RIBE與輻射有關的癌癥風險的不確定性。近年來在3D組織和動物中關于RIBE的研究越來越多，愈來愈顯示其在輻射研究中的重要性。RIBE是在高低劑量下發生的現象，其實際意義體現在對癌癥的危險評價及腫瘤放療計劃的影響。3D組織和動物模型更接近人體內的復雜生長環境，對于研究RIBE的傳遞和機制具有重要的意義。

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Q 691

A

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時間：2015-11-18 10：12：35

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2015-09-08接收

安徽省自然科學基金（編號：1408085QH161）

中科院合肥物質科學研究院醫學物理與技術中心輻射生

物醫學研究室，合肥 230031

吳文青，女，碩士研究生；

聶莉莉，女，高級工程師，責任作者，E-mail：xiao433＠sina.com

*對本文具有同等貢獻