miR375過表達下調Nit-1細胞中肌侵蛋白的表達*

夏華強，廖聆燕，周建萍，唐愛發

（1.湖南省株洲市中心醫院生殖中心，湖南 株洲 412000；2.深圳大學第一附屬醫院，廣東 深圳 518060）

·論著·

miR375過表達下調Nit-1細胞中肌侵蛋白的表達*

夏華強1，廖聆燕1，周建萍1，唐愛發2

（1.湖南省株洲市中心醫院生殖中心，湖南 株洲 412000；2.深圳大學第一附屬醫院，廣東 深圳 518060）

目的為研究miR375對肌侵蛋白（MTPN）表達的影響，探尋miR375在糖尿病中的作用。方法該研究用質粒pAAV-miR375轉染Nit-1細胞48 h后，分別通過Real time RT-PCR和Northern Blot檢測Nit-1細胞中miR375的表達，Western Blot檢測Nit-1細胞中MTPN蛋白的表達。結果在轉染pAAV-miR375的Nit-1細胞中miR375的表達明顯升高，是轉染空質粒pAAV-MCS和未轉染的6倍。MTPN蛋白的表達與轉染了空質粒pAAV-MCS和未轉染的Nit-1細胞相比，明顯下降。結論在Nit-1細胞中miR375過表達引起了MTPN蛋白表達下調，推測miR-375可能是通過調節MTPN基因的表達來調控胰島素分泌的，從而影響體內血糖的濃度。

miR375；Myotrophin（MTPN）；Nit-1細胞

miR375是胰腺中特異表達的miRNA之一。POY等證明在β細胞中miR375的過度表達可以抑制由葡萄糖所誘發的胰島素分泌；相反，內源性miR375被抑制后則可以促進胰島素的分泌[1]。WIGARD等發現在斑馬魚中miR375被敲除后，胰島細胞在胰腺中呈分散分布[2]。NATHAN等研究發現miR375的過表達引起了β細胞基因表達的重新激活，并且下調細胞的分化，認為miR375表達上調后有利于胰島素生成細胞的形成[3]。生物信息分析顯示肌侵蛋白（mytrophin，MTPN）是miR375的目的蛋白之一，通過MTPN調節β細胞胰島素的分泌[4]。本研究用質粒pAAV-miR375轉染Nit-1細胞來觀察miR375對MTPN表達的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

質粒pAAV-miR375構建見文獻[5]，Nit-1細胞購自美國ATCC，低糖DMEM培養基購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，XbaⅠ、HindⅢ、T4 DNA連接酶和DNase I酶購自NEB公司，PCR Taq酶購自Fermentas公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質粒小抽試劑盒購自Takara公司，Trizol試劑和LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，mirVanaTMqRT-PCR miRNA Detection Kit和mirVanaTMqRTPCR Primer Set for Normalization（U6）試劑盒購自Ambion公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染Nit-1細胞用含10%FBS的低糖DMEM培養基培養于5%二氧化碳CO2、37℃的恒溫箱中，每3 d傳代1次。在轉染質粒前將細胞傳入六孔板中，然后將pAAV-miR375用LipofectamineTM2000轉染至Nit-1細胞，轉染方法按說明書操作。

1.2.2 RealtimeRT-PCR檢測Nit-1細胞中miR375的表達收集轉染pAAV-miR375 48 h后的Nit-1細胞，用Trizol法提取總RNA，經DNase I處理。用mirVanaTMqRT-PCR miRNA Detection Kit和mir-VanaTMqRT-PCR Primer Set for Normalization（U6）做Real-time RT-PCR檢測Nit-1細胞中miR375的表達，操作按說明書進行。

1.2.3 Northern blot檢測Nit-1細胞中miR375的表達Nit-1細胞轉染pAAV-miR375 48 h后收集細胞，用Trizol法提取總RNA，取20μg總RNA經12%尿素變性聚丙稀酰胺凝膠電泳，120 V約1.5 h。電泳結束后于半干電泳儀上以100 mA轉膜2 h，紫外交聯儀上用紫外交聯125 mJ，80℃烘烤1 h。用32P-labeled LNA375作探針進行雜交，洗膜，放射自顯影。檢測轉基因動物中成熟miR375的表達。

1.2.4 Western blot檢測Nit-1細胞中MTPN的表達Nit-1細胞轉染pAAV-miR375 48 h后收集細胞，抽提蛋白做Western blot。取相同量的蛋白10%的聚丙稀酰胺電泳，半干轉到PVD膜中一抗anti-myotrophin antibody（1∶300 B&D，USA）4℃孵育過夜，含0.1%x-triton的PBS洗5次，二抗Goat anti-mouse IgG（200μg/ml）（1∶10 000 Sigma）4℃孵育4 h，含0.1%x-triton的PBS洗5次，顯影、曝光。

2 結果

2.1 RealtimeRT-PCR檢測Nit-1細胞中miR375的表達

用pAAV-miR375轉染Nit-1細胞48 h后，Trizol法提取Nit-1細胞的總RNA，經DnaseI酶處理，定量RT-PCR檢測Nit-1細胞中miR375的表達。結果表明，在轉染pAAV-miR375 48 h后的Nit-1細胞中miR375的表達是轉染空質粒pAAV-MCS和未轉染的6倍。Real-time RT-PCR檢測Nit-1細胞中miR375的表達（見圖1）。

圖1 Real-time RT-PCR檢測Nit-1細胞中miR375的表達

2.2 Northern blot檢測Nit-1細胞中miR375的表達

用pAAV-miR375轉染Nit-1細胞48 h后，Trizol法提取Nit-1細胞RNA，取20μg總RNA做Northern blot。結果顯示，在轉染質粒48 h后的Nit-1細胞中檢測到miR375的表達比轉pAAV-MCS質粒和未轉染的明顯升高。Northern blot檢測Nit-1細胞中miR375的表達（見圖2）。

圖2 Northern blot檢測Nit-1細胞中miR375的表達

2.3 Western blot檢測Nit-1細胞中MTPN的表達

Nit-1細胞轉染pAAV-miR375 48 h后收集細胞，抽提蛋白做Western blot檢測Nit-1細胞中MTPN的表達。結果顯示，在轉染質粒48 h后的Nit-1細胞中MTPN的表達明顯下調，而在轉pAAV-MCS質粒和未轉染的Nit-1細胞中MTPN的表達無變化。Western Blot檢測Nit-1細胞中MTPN的表達（見圖3）。

圖3 Western Blot檢測Nit-1細胞中Myotrophin（MTPN）蛋白的表達

3 討論

miR375在糖尿病的發生、發展和治療過程中起重要的作用，HIGUCHI和ZHU的研究都發現miR375是II型糖尿病的一個新的生物標記[6-7]。II型糖尿病患者血清中miR375的水平和啟動子的甲基化都有明顯的不同[8-9]。

鑒于miR375的重要作用，為解決糖尿病治療中細胞移植缺乏細胞來源的問題，很多研究者用miR375誘導非β細胞成為分泌胰島素的細胞。SHAER等用人miR375轉染胎盤的基蛻膜間充質干細胞，4和6 d后real-time PCR檢測發現胰腺發育相關基因Ins、Ngn3、GLUT2、PAX4、PAX6、KIR6. 2、NKX6.1、PDX1及glucagon表達，轉染6 d后用免疫化學法檢測發現Ins和Ngn3的蛋白表達。他們認為通過轉染miR375，間充質干細胞能成為生成胰島素的細胞[10]。SHAER A等用人miR375和人miR186共同轉染誘導的多能干細胞，轉染24和48 h后real-time PCR檢測發現胰腺發育相關基因Ins、Ngn3、GLUT2、PAX4、PAX6、KIR6.2、NKX6.1、PDX1及glucagon表達。轉染第3天，用免疫細胞化學法檢測發現Ins和Ngn3的蛋白表達。他們認為通過轉染人miR375和人miR186，誘導多能干細胞能成為生成胰島素的細胞[11]。用Sox2、Klf4、cMyc和Oct4轉入人皮膚成纖維細胞誘導成多能干細胞，然后轉入miR375成功將多能干細胞誘導成分泌胰島素的細胞[12]。

生物信息分析顯示Mytrophin（MTPN）是miR375的目的蛋白之一。該研究結果發現，在與轉染了空質粒和未轉染的Nit-1細胞相比，轉染pAAV-miR375的Nit-1細胞中miR375的表達升高6倍，MTPN蛋白的表達明顯下降。這說明在Nit-1細胞中miR375過表達引起了MTPN蛋白表達下調。

miR-375是通過以下方式調節胰島素的分泌，正常情況下MTPN與抑制F-actin表達的Capz蛋白相結合，F-actin正常表達。當miR-375高表達時成熟的miR-375與MTPN 3未翻譯區結合從而降低了MTPN蛋白的表達，與MTPN相結合的Capz蛋白游離出來抑制F-actin表達，F-actin的網絡結構發生改變，actin網孔出現重排，大量的胰島素分泌顆粒不能排出細胞外[13]。相反，當miR-375表達降低時，大量的胰島素分泌顆粒排出細胞外。另外MTPN/ V-1與IκBα蛋白具有非常相似的結構，作為一個轉錄因子激活NF-κB。在細胞中NF-κB的激活可以改善細胞骨架結構，提高葡萄糖刺激的胰島素分泌。相反，NF-κB的活性降低時會抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌[14]。推測miR-375可能是通過MTPN基因來調控胰島素分泌的，這可能成為糖尿病治療中的一個新方向。

[1]POY MN,ELIASSON L,KRUTZFELDT J,et al.A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion[J].Nature,2004, 432(7014):226-230.

[2]WIGARD PK,ANNE KL,RENE FK,et,al.Targeted inhibition ofmiRNAmaturationwithmorpholinosrevealsarolefor miR-375 in pancreatic islet development[J].PLoS BIOLOGY, 2007,5(8):1738-1749.

[3]NATHAN GL,KREDO-RUSSO S,GEIGER T,et al.MiR-375 promotes redifferentiation of adult human β cells expanded in vitro[J].PLoS One,2015,10(4):e0122108.

[4]MATTHEW N POY,JEAN H,MIRKO TKI,et al.MiR-375 maintains normal pancreatic α-and β-cell mass[J].PNAS, 2009,106(14):5813-5818.

[5]夏華強,潘藝,劉律君,等.miRNA375表達質粒的構建及表達研究[J].中國現代醫學雜志,2010,22(5):652-655.

[6]HIGUCHI C,NAKATSUKA A,EGUCHI J,et al.Identification of circulating miR-101,miR-375 and miR-802 as biomarkers for type 2 diabetes[J].Metabolism,2015,64(4):489-497.

[7]ZHU H,LEUNG SW.Identification of microRNA biomarkers in type 2 diabetes:a meta-analysis of controlled profiling studies[J]. Diabetologia,2015,58(5):900-911.

[8]CHANG X,LI S,LI J,et al.Ethnic differences in microRNA-375 expression level and DNA methylation status in type 2 diabetes of han and kazak populations[J].J Diabetes Res,2014, 2014(76):19-38.

[9]SUN K,CHANG X,YIN L,et al.Expression and DNA methylation status of microRNA-375 in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Mol Med Rep,2014,9(3):967-972.

[10]SHAER A,AZARPIRA N,VAHDATI A,et al.MiR-375 induces human decidua basalis-derived stromal cells to becomeinsulin-producing cells[J].Cell Mol Biol Lett,2014,19(3): 483-499.

[11]SHAER A,AZARPIRA N,KARIMI MH,et al.Differentiation of human induced pluripotent stem cells into insulin-like cell clusters with miR-186 and miR-375 by using chemical transfection[J].Appl Biochem Biotechnol,2014,174(1):242-258.

[12]LAHMY R,SOLEIMANI M,SANATI MH,et al.MiRNA-375 promotesbetapancreaticdifferentiationinhumaninduced pluripotent stem(hiPS)[J].Cells,2014,41(4):2055-2066.

[13]HAMMAR EB,IRMINGER JC,RICKENBACH K,et al.Activation of NF-kappa B by extracellular matrix is involved in spreading and glucose-stimulated Insulin secretion of pancreatic beta cells[J].J.Biol Chem,2005,280(34):306-307.

[14]NORLIN S,AHLGRE U,EDLUND H.Nuclear factor-{kappa}B activity in{beta}-cells is required for glucose-stimulated Insulin secretion[J].Diabetes,2005,54(1):125-132.

Over-expression of miR-375 reduces MTPN in Nit-1 Cells*

Hua-qiang XIA1,Ling-yan LIAO1,Jian-ping ZHOU1,Ai-fa TANG2
(1.Department of Reproduction Center,Zhuzhou Central Hospital,Zhuzhou,Hunan 412000,P.R. China;2.The First Hospital of ShenZhen University,Shenzhen,Guangdong 518060,P.R.China)

【Objective】To study the effect on the expression of Myotrophin(MTPN)and finding the function of miR375 in diabetes.【Methods】48 hour after the pAAV-miR375 plasmid transfected into the Nit-1 cells,the expression of miR375 in the Nit-1 cells was analyzed by Real-time PCR and Northern Blot.The protein expression of MTPN in the Nit-1 cells was analyzed by western Blot.【Results】The expression of miR375 was increase 6 times in the Nit-1 cells transfected with pAAV-miR375,camper to the Nit-1 cells transfected with control plasmid or untransfected.The expression of MTPN was reduced apparently in the Nit-1 cells transfected with pAAV-miR375, camper to the Nit-1 cells transfected with control plasmid or untransfected.【Conclusion】Over-expression of miR-375 reduced the expression of Mtpn in Nit-1 cells in vitro,adjusting the blood glucose.

miR375;Myotrophin(MTPN);Nit-1 cells

R587.1

A

1005-8982（2015）31-0001-04

2015-06-12

國家自然科學基金（No：81270740）、湖南省衛生計生委2015年度科研計劃課題項目（No：B2015-159）、株洲市年度醫療衛生領域指導性計劃（No：2014YW01）

夏華強，E-mail：56338895@qq.com，Tel：0731-28561175