microRNA181b在老年肝細胞癌中的表達水平及其對癌細胞遷移的影響

夏云展，解寒冰，孫德利，李瓊

（河南省鄭州人民醫院1.普通外科，2.神經內科，河南 鄭州 450000）

·論著·

microRNA181b在老年肝細胞癌中的表達水平及其對癌細胞遷移的影響

夏云展1，解寒冰1，孫德利1，李瓊2

（河南省鄭州人民醫院1.普通外科，2.神經內科，河南 鄭州 450000）

目的探討microRNA-181b在老年肝細胞癌（HCC）組織以及患者血漿中的表達水平以及對肝癌細胞遷移的影響。方法選取該院40例HCC患者為研究組，40例同期來該院體檢的人群為對照組，采用實時熒光定量RT-PCR法檢測老年肝細胞癌組織及對應癌旁組織中以及患者和正常人群血漿中microRNA-181b表達水平；對人肝癌細胞SMMC-7721干擾microRNA-181b后，采用transwell法觀察其侵襲水平；并采用RT-PCR以及Western blot檢測了SMMC-7721細胞中CXCR4的mRNA及蛋白水平。結果microRNA-181b在肝細胞癌組織中的表達水平顯著高于對應癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）；microRNA-181b在肝癌患者血漿中的表達水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。Spearman相關分析顯示，microRNA-181b在肝細胞癌組織及血漿中表達與肝癌的分化程度均呈顯著正相關（r=0.572，P＜0.05；r= 0.616，P＜0.05）；而肝癌癌旁組織中microRNA-181b表達與肝癌分化程度無顯著相關（r=0.216，P＞0.05）。干擾microRNA-181b的SMMC-7721細胞遷移能力顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；且干擾microRNA-181b的SMMC-7721細胞CXCR4的mRNA及蛋白水平降低。結論microRNA-181b在老年肝細胞癌組織中高表達，并且與肝癌細胞的分化程度關系密切，microRNA-181b可能通過影響CXCR4來促進肝癌細胞的遷移。

microRNA-181b；原發性肝細胞癌；遷移；CXCR4

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），簡稱肝癌，是惡性程度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發病率的第5位、死因的第3位，全世界每年大約有100萬人死于肝癌，其中老年人是高發人群[1]。然而目前為止，肝癌的發病機制尚未完全明確，人們普遍認為癌基因的激活或者是抑癌基因的異常失活是導致肝癌發生的主要原因。MicroRNA（miRNA）是一類新近發現的長度約為22個核昔酸的非編碼單鏈小分子RNA。隨著對miRNA的深入研究發現，其異常表達與肝癌的發生發展有著極其密切的聯系[2-4]。microRNA-181b是較早發現的的人類miRNA之一，有研究認為microRNA-181b卵巢癌患者中高表達，且能夠促進細胞的生長和侵襲[5]，而microRNA-181b在非小細胞肺癌患者中低表達[6]。然而，目前為止，microRNA-181b在肝癌患者的表達高低極其對肝癌細胞潛在的功能的研究尚少報道。本研究對比了microRNA-181b在老年肝細胞癌及對應癌旁組織中的表達，分析其在肝細胞癌中的表達水平及其與臨床病理特征的聯系，并探討其對肝細胞癌侵襲極其機制的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

所有組織來源于2012年8月-2014年2月期間來本院就醫的老年患者的手術切除標本。其中，研究組中共40例。其中，男18例，女22例；年齡61～75歲，平均（64.12±8.18）歲。術前均未經任何介入或化療等任何處理，所有患者均接受了肝癌根治性切除手術處理，所有組織標本經術后病理學證實為肝細胞癌，分別取肝癌及對應癌旁組織待用。對照組為同期健康體檢人群40例。其中，男19例，女21例；年齡60～73歲，平均（65.21±7.98）歲。肝癌的組織于術中離體30 min內取材，經10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片備用。HCC組織根據Edmondson標準分級：Ⅰ級6例；Ⅱ級11例；Ⅲ級13例；Ⅳ級10例。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒Trizol購于Gibco公司，逆轉錄試劑盒購于美國Femantes公司，DNA Marker、 PCR試劑盒、焦碳酸二乙脂（DEPC）均購于生興生化科技（南京）有限公司，microRNA-181b的抑制物及U6內參的引物由廣州銳博生物科技有限公司設計合成。

1.3 組織以及血漿標本總RNA提取及逆轉錄反應

肝細胞癌患者手術中取肝癌及對應癌旁組織。此外，清晨空腹時抽取肝癌患者及正常人群的外周靜脈血5 ml，加入EDTA抗凝劑，2 h內于4℃下高速離心4 000 g，5 min。離心后提取上層血漿放入-80℃保存備用。

取約150 mg組織或200 ml血漿，加入1 ml Trizol，充分勻漿，抽提總RNA，所得RNA溶于25 ml的DEPC水中。提取的總RNA經紫外分光光度計進行定量及檢測純度。進一步用Femantes逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，cDNA產物-20℃保存備用。PCR反應條件：95℃變性20 s，然后60℃20 s和70℃1 s進行40個循環。

1.4 細胞轉染

采用脂質體2000（美國Invitrogen公司）對人的肝癌細胞SMMC-7721中microRNA-181b低表達，于48 h候檢測其干擾效率。

1.5 細胞培養及遷移實驗

改良型RPMI1640培養基購自HyClone公司，胎牛血清（FBS）購自美國GIBCO公司，人肝癌細胞系SMMC-7721購自于中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。SMMC-7721培養于含100 ml/L的胎牛血清的改良型RPMI1640培養基中，置于37℃，50 ml/L的CO2細胞培養箱中培養。穩定傳代3代后，取對數生長期細胞進行實驗，調整肝癌細胞密度至3×l05個/ml，按0.1 ml/孔加入到transwell小室的上層，小室下層加入1 ml的含有10%血清的培養液。培養24 h時間后，對己遷移至小室下層的細胞進行計數（隨機選取5個視野）。

1.6 免疫印跡檢測蛋白水平

收集SMMC-7721細胞，加入1×SDS細胞裂解液，進行SDS-PAGE電泳，100 V電壓轉膜10 min，37℃封閉90 min，加兔抗人的CXCR4（Biolegend）4℃孵育過夜后，HRP標記的小鼠抗兔二抗（南京生興生物）（1∶1 000稀釋）37℃孵育30 min，ECL發光檢測。內參蛋白選用sigma公司的抗人-actin（1∶3 000稀釋）。

1.7 統計學方法

統計作圖用GraphPad Prism 4.0軟件，采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。兩組間差異比較采用Student’st檢驗，兩變量參數相關分析采用Pearson相關性分析，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝細胞癌組織及對應癌旁組織中microRNA-181b mRNA的表達水平

與癌旁組織比較，microRNA-181b在肝癌組織中mRNA的表達水平顯著增高，差異有統計學意義（t=13.77，P＜0.05），以上結果提示高表達的microRNA-181b在原發性肝細胞性肝癌的發生發展中可能發揮重要的調節功能。見表1。

表1 肝癌及對應癌旁組織中microRNA-181bmRNA的表達水平

2.2 肝細胞癌患者血漿中microRNA-181b mRNA的表達水平

microRNA-181b在肝細胞癌患者血漿中mRNA表達水平顯著高于正常人群，差異有統計學意義（t= 15.63，P＜0.05），進一步提示了肝細胞癌患者血漿中高表達microRNA-181b與肝癌的進展有著密切的聯系。

2.3 肝細胞癌組織及血漿中microRNA-181b表達水平與肝癌組織病理分級的相關性

相關分析結果顯示肝癌組織中microRNA-181b mRNA表達水平與肝癌的分化程度顯著正相關（r= 0.591，P＜0.05）（表3），且血漿中microRNA-181b mRNA表達水平與肝癌組織的分化程度顯著正相關（r=0.637，P＜0.05）（表3），提示了肝細胞癌的分化愈差，microRNA-181b表達愈強。而肝癌患者癌旁組織中microRNA-181b mRNA表達與肝癌的分化程度未見顯著相關（r=0.253，P＞0.05）（表3）。

表2 肝癌患者及正常人群血漿中microRNA-181bmRNA的表達

表3 microRNA-181b mRNA表達強度與肝細胞癌分化程度的關系

圖1 低表達microRNA-181b對肝癌細胞侵襲的影響

2.4 低表達microRNA-181b對肝癌細胞侵襲功能的影響

SMMC-7721細胞轉染microRNA-181b抑制物后，microRNA-181b水平顯著降低（圖1A），說明低表達效果成功。與對照組比較，SMMC-7721細胞轉染microRNA-181b抑制物后，transwell小室下層細胞數量顯著減少（圖1B），差異具有統計學意義（P＜0.05），提示了microRNA-181b具有促進肝癌的癌細胞侵襲能力。

2.5 干擾microRNA-181b對肝癌細胞CXCR4的mRNA和蛋白表達影響

為了探討microRNA-181b對于SMMC-7721細胞侵襲影響的機制，我們檢測干擾microRNA-181b基因后肝癌細胞的CXCR4的水平。結果發現，與對照組比較，干擾microRNA-181b的肝癌細胞表達CXCR4的mRNA（2A）和蛋白（2B）水平均顯著降低，提示了microRNA-181b可能是通過促進肝癌細胞CXCR4的表達來影響癌細胞的侵襲能力。

圖2 低表達microRNA-181b對肝癌細胞遷徙基因CXCR4水平影響

3 討論

肝癌是世界上比較常見的一種惡性腫瘤，它的診斷和治療一直都是臨床上的難題之一。目前認為，原發性肝癌的發生及發展是一個涉及到多基因、多通路、多步驟的復雜過程[7]。因此，尋找到肝癌特異性的診斷靶點成為人們感興趣的科學問題。目前，一般認為導致肝癌發生的主要原因為抑癌基因的異常失活或者致癌基因的激活[8]。近年來，表觀遺傳學及其對于惡性腫瘤的調控機制越來越多的被人們進行深入的研究，這對尋找到腫瘤發生發展的關鍵表觀遺傳分子，為癌癥的早期診斷和治療提供重要的參考依據。

microRNA作為一種在轉錄水平調節基因表達的約22個核苷酸大小的小分子RNA，廣泛的存在于組織、血漿或血清以及其他體液中，且在體內表達比較穩定。近年來，腫瘤的表觀遺傳學調控和microRNA分子的調控越來越受到關注。microRNA在多種惡性腫瘤的發生、發展以及預后中具有及其重要的作用：既具有抑癌基因又具有癌基因的特性，其可對一系列重要的抑癌或者促癌基因的起著重要的調控作用[9-13]。

本研究檢測microRNA-181b在老年肝癌患者癌組織及對應癌旁組織中的表達，結果發現，肝癌組織中microRNA-181b的表達水平均高于對應的癌旁組織，且與肝癌Edmonson分級顯著正相關；此外，肝癌患者血漿中microRNA-181b表達高于正常人群，且與肝癌的臨床分期顯著正相關，這些結果均說明了microRNA-181b在肝癌患者癌組織以及血漿中的表達水平可能與肝癌發生發展有密切的聯系。MENG等[14]學者在分析胰腺癌組織時發現microRNA-181b較正常對照組顯著上調，且發現microRNA-181b能夠促進癌細胞的增殖，這與本研究基本一致。

趨化因子受體4（CXCR4）是CXC趨化因子亞家族中一類重要的受體，其在腫瘤中發揮多種作用，特別是與腫瘤細胞的遷移等密切相關[15]。為了探索microRNA-181b影響肝癌細胞的遷移機制，筆者檢測了低表達microRNA-181b的肝細胞中CXCR4的表達，結果發現，干擾microRNA-181b的肝癌細胞表達CXCR4的mRNA和蛋白水平均降低，從而提示microRNA-181b通過增加肝癌細胞表達CXCR4來促進肝癌細胞的遷移。分析其機制可能是CXCR4通過增加可使細胞肌動蛋白絲聚合，形成偽足，引起定向遷移、侵襲，利于腫瘤生長。這與Nikzaban, Mehrnoush等認為在胃癌細胞中CXCR4表達水平與胃癌侵襲和浸潤密切相關的結果一致[16]。

綜上所述，microRNA-181b在肝癌的發生、發展中起著重要的作用，老年肝癌患者癌組織以及血漿中microRNA-181b的檢測對于對患者臨床個體化治療以及預后可能具有一定的指導意義。

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Expression of microRNA181b in primary hepatocellular carcinoma in the elderly and the effects of cancer cell migration

Yun-zhan XIA1,Han-bing XIE1,De-li SUN1,Qiong LI2
(1.Department of General Surgery;2.Department of Neurology,Zhengzhou People's Hospital, Zhengzhou,Henan 450003,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of microRNA-181b in primary HCC tissue and plasma of patients as well as migration of hepatoma cells.【Methods】40 cases of primary HCC patients in our hospital as the study group,40 healthy volunteers were used as control group,we used RT-PCR to detect the expression of microRNA-181b in liver cancer and adjacent cancer tissues.After SMMC-7721 interference microRNA-181b,invasion levels were observed using transwell law;and detect the mRNA and protein levels of CXCR4 by RT-PCR and Western blot.【Results】the expression of microRNA-181b in primary HCC tissues was significantly higher than the corresponding adjacent tissues,the difference was statistically significant(P＜0.05);expression of microRNA-181b in primary liver cancer patients was significantly higher in the plasma,the difference was statistically significant(P＜0.05).The expression of microRNA-181b in primary HCC tissue and plasma and liver cancer were significantly positively correlated by Spearman correlation analysis(r=0.572,P＜0.05;r=0.616,P＜0.05).The mRNA and pro－tein levels of CXCR4 were reduced after interference of microRNA-181b in SMMC-7721 cells.【Conclusion】the expressions of microRNA-181b in elderly primary HCC are increased and closely related to the degree of differentiation,microRNA-181b may be to facilitate the migration of liver cancer cells by affecting CXCR4.

microRNA-181b;primary hepatocellular carcinoma;migration;CXCR4

1005-8982（2015）31-0017-05

R735.7

A

2015-06-17