水溶蜂膠對人牙髓成纖維細胞的毒性作用研究*

劉穎婷，張玉皓

[云南省第一人民醫院（昆明理工大學附屬昆華醫院）牙周種植科，云南 昆明 650032]

·論著·

水溶蜂膠對人牙髓成纖維細胞的毒性作用研究*

劉穎婷，張玉皓

[云南省第一人民醫院（昆明理工大學附屬昆華醫院）牙周種植科，云南 昆明 650032]

目的探討水溶性蜂膠對人牙髓成纖維細胞的毒性作用，為蜂膠的臨床應用提供理論依據。方法用一種新的四唑類化合物MTS比色法檢測人牙髓細胞在不同濃度的蜂膠、氫氧化鈣溶液中體外培養48 h后細胞的相對增殖率(RGR)，用5級毒性分類法評級。結果1 g/L及以下濃度的水溶蜂膠組對人牙髓成纖維細胞的毒性級別在2以下。結論1 g/L及以下濃度的水溶蜂膠液對人牙髓成纖維細胞的毒性作用較小，是治療牙髓疾病的安全藥物。

水溶蜂膠；人牙髓成纖維細胞；細胞毒性

蜂膠是蜜蜂采集膠源植物的芽孢滲出物中的天然樹脂，混合其上顎腺的分泌物，花粉及蜂蠟形成的褐色膠狀物質，是天然蜂產品之一。它含有多種生理活性物質，具有廣泛的生理和藥理作用，更是天然的抗生素，具有較強的抗菌性能,目前在根管消毒，牙周炎和口腔黏膜疾病的治療領域有廣泛的研究和應用。本研究采用最新的一種檢測細胞毒性的四唑類化合物MTS[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfopheny）-2H-tetrazolium，inner salt]比色方法檢測國產水溶性蜂膠對人牙髓成纖維細胞的毒性作用，探討蜂膠在牙髓治療領域的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

水溶性固體蜂膠：上海辰蜂生物技術公司提供，氫氧化鈣粉：上海二醫張江生物材料有限公司生產。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM細胞培養基（Hyclone）、澳洲胎牛血清（普飛）、0.5 g/L胰蛋白酶（Hyclone）和96孔細胞培養板均由諾貝生物科技有限公司提供。MTS（普洛麥格生物技術有限公司），二氧化碳培養箱（美國Therm-Fisher Forma 3111），超凈工作臺（SW-CJ-1D型，蘇州凈化設備有限公司），高速低溫離心機（日本HITACHI集團CR22G），小鼠抗人波形絲蛋白單克隆抗體（福州邁新公司），小鼠抗人角蛋白單克隆抗體（福州邁新公司），酶標儀（ST360，上?？苹瘜嶒炏到y有限公司）。

1.3 人牙髓成纖維細胞的培養及傳代

牙髓標本取自昆明醫學院附屬口腔醫院頜面外科門診，取臨床青少年因正畸減數需要拔除的健康恒前磨牙4～5顆，立即置入含有3%雙抗的DMEM培養液中帶回。在科室用碘酊、乙醇依次消毒牙冠，無菌高速渦輪機頭除去表面牙周組織，裂鉆環形切割牙頸部至近髓后立即置入培養液中帶到實驗室。在超凈工作臺內，骨鑿劈開牙冠，用無菌的K銼謹慎從根管中抽出牙髓迅速剪去根尖1/3，置入浸有培養液的培養皿中，用無菌眼科剪剪成0.5 mm3組織塊，然后用DMEM培養液沖洗3次，探針將組織塊挑入培養瓶底部，以0.5 mm的間距均勻鋪置，對側壁滴入培養液，瓶底向上置入二氧化碳培養箱中，靜置4 h貼壁后翻轉，再加入適量培養液靜置于培養箱中培養，組織塊未游出細胞前每周換液一次，細胞游出后每3天換液一次，在倒置顯微鏡下觀察細胞游出及生長情況，待細胞達到匯合點時，用0.5 g/L的胰酶消化，按1∶2傳代，原代培養的人牙髓細胞傳至第4代后，免疫組織化學染色鑒定細胞的組織來源。細胞繼續傳代至第5代，取生長良好的第5代牙髓細胞進行細胞接種備用。

1.4 蜂膠水溶劑的配制

取國產水溶蜂膠用三蒸水將其配成1 g/10 ml的蜂膠溶液，0.2μm的無菌過濾器濾后再用含有10%胎牛血清的DMEM培養液稀釋成4、2、1、0.6和0.2 g/L 5個濃度備用。對照的氫氧化鈣溶液配制：將200 mg氫氧化鈣干粉劑溶于50 ml的三蒸水中，3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，0.2μm的無菌過濾器濾后用含有10%胎牛血清的DMEM培養液稀釋成10%、8%、4%、1%4個濃度備用。

1.5 人牙髓細胞相對增殖率的測定

Cell Titer 96@A Queous One Solution Cell Proliferation Assay（a）是一種用比色法來檢測細胞增殖和細胞毒實驗中的活細胞數量的新的檢測試劑，此試劑含有一個新型的四唑化合物MTS和一種電子偶聯劑PES。PES具有增強的化學穩定性，這使它可與MTS混合形成穩定的溶液，是方便的單溶液模式。MTS被細胞生物還原成為一種有色的甲臜產物，可直接溶解于培養基中，這種轉換是由代謝活躍的細胞中的脫氫酶產生的還原型煙酰胺腺嘌呤二核甘酸磷酸（NADPH）或煙酰胺腺嘌呤二核甘酸磷酸（NADH）的作用下完成的。檢測時，只需將少量的Cell Titer 96@AQueous One Solution Reagent試劑直接加入培養板孔的培養基中，孵育1～4 h，然后用酶標儀讀取490 nm的吸光度值，操作步驟比MTT更少，更方便快捷。在490 nm處檢測到的甲臜產物的量與培養中的活細胞數成正比。

本實驗采用MTS比色法，檢測不同濃度的蜂膠水溶劑和氫氧化鈣溶液作用于人牙髓細胞后的吸光度（OD值），計算細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）：RGR=實驗組OD值/陰性對照組OD值×100%，根據RGR換算細胞毒性的級別。

具體方法如下：取生長良好的第5代牙髓細胞，0.5 g/L胰蛋白酶消化，離心后用含有10%胎牛血清的DMEM培養液吹打成單細胞懸液，用細胞計數板調整細胞濃度至2×104/ml，接種于96孔板，每孔100μl。放置到37℃、5%二氧化碳培養箱中培養48h，倒置顯微鏡下觀察大多數細胞貼壁并生長。棄去孔內液體及不貼壁的細胞，將各稀釋藥液加入96孔板中，每種加5孔，每孔100μl；陰性對照組加含有10%胎牛血清的DMEM培養液，每孔100μl。在預實驗中，筆者發現蜂膠的顏色也對吸光度產生一定的影響，因此在每組蜂膠實驗組的上方還設一組不含細胞的蜂膠液對比孔，在該對照孔中加對應濃度的蜂膠液100μl。用該蜂膠組的OD值減去該孔的OD值以排除蜂膠色度對實驗組吸光度的影響，96孔板置37℃，體積分數5%二氧化碳條件下培養48 h后，每孔加入20μl配好的MTS試劑，再放回培養箱中放置4 h取出，在酶標儀上振蕩30 s，于490 mm波長下測OD值，每種濃度孔的OD值取平均值。計算細胞RGR，根據細胞毒性評級標準（見表1），用RGR值換算細胞毒性級。

表1 細胞毒性評級標準

1.6 統計學方法

采用SPSS 11.0統計軟件進行數據分析，對實驗結果組間進行方差分析，對蜂膠與氫氧化鈣總體細胞毒性進行兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞的培養和形態學觀察

本研究用傳統的組織塊培養法，12～15 d內可見有的組織塊周邊有少量梭形細胞長出，2～3 d后細胞迅速擴增，約18～20 d左右細胞長滿瓶底。按1∶2傳代，2～3 d可傳一代。原代及傳代培養的細胞胞體呈長梭形，星形胞體細長，胞漿豐富，核位于中央，排列緊密多呈近于平行的束狀，細胞界限清楚，呈“漩渦狀”。見圖1。

圖1 牙髓成纖維細胞圖（×200）

2.2 細胞來源鑒定

取第4代對數生長期人牙髓細胞爬片，按試劑盒說明書進行波形絲蛋白，角蛋白免疫組織化學染色，光鏡下觀察。牙髓成纖維細胞呈典型的成纖維樣細胞，細胞漿內波形絲蛋白染色為陽性，角蛋白染色呈陰性。波形絲蛋白是成纖維細胞的特征性蛋白，而角蛋白是上皮細胞的特征性蛋白，因此證實培養的是中胚層來源的人牙髓成纖維細胞。見圖2、3。

圖2 波形絲蛋白染色陽性（×100）

圖3 角蛋白染色陰性（×100）

2.3 細胞相對增殖率結果及毒性分級

第5代人牙髓成纖維細胞以2×104/ml，接種于96孔板，培養48 h后，各孔細胞密度均勻。細胞貼壁生長，形態正常，胞體呈長梭形。加樣48 h后，陰性對照組細胞密度增加，形態正常；加藥物的實驗組和對照組，低濃度的各孔中細胞形態基本正常，隨著濃度的增加，培養孔中出現變性死亡細胞，部分細胞漂浮起來。各孔加入MTS試劑后，放回培養箱中孵育4 h，取出后用酶標儀測定各孔的吸光度。不同濃度蜂膠水溶液與氫氧化鈣溶液對人牙髓成纖維細胞作用48 h后的吸光度值、換算的細胞相對增殖率及毒性級別如下，見表2。

表2 蜂膠和氫氧化鈣溶液對人牙髓成纖維細胞作用48 h后的OD值及毒性級別結果

對蜂膠組各濃度OD值進行方差分析，F=30.618，P＜0.05，差異有統計學意義，認為不同濃度下的蜂膠OD值不同。對氫氧化鈣組各濃度OD值進行方差分析，F=44.275，P＜0.05，差異有統計學意義，認為不同濃度下的氫氧化鈣OD值不同。對蜂膠和氫氧化鈣總體細胞毒性進行兩獨立樣本t檢驗，t=0.882，P＜0.386，差異無統計學意義，表明蜂膠和氫氧化鈣總體細胞毒性無差異。

3 討論

由于牙髓組織具有形成牙本質和營養硬組織的功能，對外來刺激能產生一系列防御性反應，因此保存活髓具有十分重要的意義。理想的蓋髓材料要有良好的封閉性，能有效地隔絕外界刺激，殺滅細菌，消除牙髓炎癥，保護牙髓。誘導牙髓細胞分化成成牙本質細胞形成修復性牙本質橋，并能提供牙髓修復，牙本質生物礦化所需要的微量元素及適宜的微環境[1]。

氫氧化鈣是目前應用最廣泛的蓋髓材料，它能有效地促進牙髓細胞分化，形成修復性牙本質封閉露髓孔，并且其強堿性也具有一定的抑菌和殺菌作用。但臨床應用也發現它有明顯的缺陷，例如它會引起接觸部位牙髓炎癥壞死；會發生牙髓退行性改變，出現根管內營養不良性鈣化，鈣化蔓延到整個根管，出現堵塞或牙內吸收等[2]。為進一步改善性能，有研究試圖用氫氧化鈣復合其他材料或激光處理的方法提高治療效果[3-4]。也有學者在探索新的蓋髓材料，目前有礦化三氧化物凝聚體（MTA）；牙本質粘接劑；磷酸鈣類材料(羥基磷灰石、磷酸鈣骨水泥，陶瓷化骨粉等)；生物活性材料（骨形成蛋白、表皮生長因子、牙本質膠原蛋白、富血小板血漿等）；抑菌類材料（各類抗生素）；中藥類（黃芩苷等）[5-11]。但各種材料各有優缺點：如磷酸鈣類材料無抗菌性；生物活性材料易被破壞；粘接劑密封性好，但有刺激性等等，單一的材料均不能達到理想的蓋髓材料應具備的性能。進一步探索具有生物誘導活性，良好的生物相容性，消炎殺菌及物理機械性能都良好的復合蓋髓材料，提高活髓保存的成功率是該領域的研究方向。由于蓋髓治療常因微滲漏或牙本質深層藏存的細菌感染而失敗，因此蓋髓劑能否殺滅露髓孔內殘余細菌，消除牙髓炎癥有重要的意義。因此有研究者試圖復合幾種材料的性能，如束紅蕾[12]等把甲硝唑，紅霉素，克林霉素加入到磷酸鈣骨水泥，陶瓷化骨粉中用于實驗動物的蓋髓，實驗研究也取得了較好的效果。

近年來，人們越來越熱衷于綠色天然藥物的開發和應用，蜂膠含有多種生理活性物質，具有廣泛的生理和藥理作用，臨床上多用于治療潰瘍、燒傷、糖尿病及心血管病等[13]。最重要的是蜂膠的強抗菌功能是其他天然物質無可比擬的，由于蜂膠含有大量的黃酮類及芳香酸、脂肪酸及烯類等多種化合物，它具有廣譜抗菌作用，能抑制多種細菌和病毒，有研究證實1%～10%的蜂膠對真菌和霉菌都有抑制作用[14]。在口腔領域關于蜂膠的研究也很廣泛，國內已有研究表明，蜂膠的生物安全性很好[15]。蜂膠對齲病、牙周病和感染根管的致病菌有明顯的殺滅及抑制作用，已有研究將其引入齲病、牙周病及感染根管消毒治療領域[16-17]。國外有研究還發現，蜂膠能有效殺滅對氫氧化鈣消毒耐受的細菌，能有效殺滅難治性根尖周炎根管內的糞腸球菌[18-19]。蜂膠的消炎鎮痛、表面麻醉、促進增生、改善微循環的作用使其對復發性口瘡、扁平苔蘚等口腔黏膜病也有較好的療效[20]，已有蜂膠的牙膏，漱口水、口腔潰瘍貼膜生產用于口腔臨床。對于牙髓治療領域，由于蜂膠含醛，有凝固蛋白的作用，國內有學者報道用蜂膠復合普魯卡因等制成的復方蜂膠失和劑可以失和牙髓[21]。國外學者研究報道，較低濃度的蜂膠醇溶劑在保持有效的殺菌效力的同時對人牙髓、牙周及牙齦成纖維細胞的細胞毒性遠低于氫氧化鈣，生物安全性好，用于蓋髓治療能誘導修復性牙本質形成[22-24]，但尚無進一步深入的研究報道。國內目前尚無水溶蜂膠對人牙髓細胞的細胞毒性及蜂膠用于蓋髓治療的實驗報告。

為進一步明確蜂膠在蓋髓治療中的性能，研究能否利用蜂膠的天然強抗菌性，豐富的物質含量和改善微循環、促進增生等多種生物活性消除暴露牙髓的炎癥，從而誘導牙髓—牙本質復合體反應形成修復性牙本質，筆者采用國產水溶蜂膠做人牙髓細胞的細胞毒性實驗。由于以前多數研究為蜂膠乙醇提取液，對蜂膠水提取液的研究非常少。在本實驗中，為降低對牙髓的刺激，并填補蜂膠水溶劑用于蓋髓治療的研究空白，采用國產水溶蜂膠制備不同濃度的蜂膠水溶劑。采用體外細胞培養技術培養人牙髓細胞，用MTS比色法檢測不同濃度的蜂膠水溶劑作用于人牙髓細胞后的OD值。計算細胞RGR，根據RGR換算細胞毒性的級別。觀察不同濃度的蜂膠水溶劑對人牙髓細胞增殖的影響，并對其細胞毒性進行評級。

實驗結果表明，水溶蜂膠及氫氧化鈣對人牙髓細胞的細胞毒性各濃度組間差異有統計學意義（P＜0.05）；對蜂膠與氫氧化鈣總體細胞毒性進行兩獨立樣本t檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05），表明蜂膠和氫氧化鈣總體細胞毒性無差異。1 g/L及以下國產水溶蜂膠溶液對人牙髓細胞的毒性在2以下，具有低毒性，可考慮用于臨床治療。

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（張蕾 編輯）

Evaluation on cytotoxicity of water-solubile propolis to human dental pulp fibroblasts*

Ying-ting LIU,Yu-hao ZHANG
[Departmenent of Periodontology and Implant Dentistry,the First People's Hospital of Yunnan Province(Kunhua Hospital Affiliated to Kunming University of Sicence and Technology),Kunming,Yunan 650032,P.R.China)

【Objective】To evaluate the cytotoxicity of water-solubile propolis to human dental pulp fibroblasts and provide information for local application of propolis to dental diseases.【Methods】Human dental pulp fibroblasts were incubated in propolis and calcium hydroxide solution at different concentrations for 48 hours.The relative growth rate(RGR)was examined by a new method of MTS assay and cytotoxicity was classified by the five-class method.【Results】The cytotoxicity of 1 g/L and lower-concentration water-solubile propolis solution to human dental pulp fibroblasts was below the second class.【Conclusion】Water-solubile propolis solution at 1 g/L and lower concentration has weak cytotoxicity for human dental pulp fibroblasts and it is safe for local application to dental pulp diseases.

water-solubile propolis；human dental pulp fibroblast；cytotoxicity

R781.3

A

1005-8982（2015）30-0018-05

2015-03-03

云南省科技廳應用基礎研究項目（No：2011FZ277）