硝酸鎵對卵巢癌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

楊紅梅王學(xué)哲

硝酸鎵對卵巢癌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

楊紅梅①王學(xué)哲②

目的：通過硝酸鎵對卵巢癌HO-8910細(xì)胞作用，分析誘導(dǎo)凋亡中對Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的情況。方法：通過對卵巢癌HO-8910細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)，Western印跡檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果：硝酸鎵組、順鉑組及聯(lián)合治療組HO-8910細(xì)胞Bcl-2的水平明顯低于空白對照組，硝酸鎵組、聯(lián)合治療組Bax、Caspase-3的水平明顯高于空白對照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：硝酸鎵對卵巢癌細(xì)胞的作用，可能與Bcl-2的表達(dá)水平下調(diào)，Bax、Caspase上調(diào)有關(guān)。

硝酸鎵； 卵巢癌細(xì)胞； 蛋白表達(dá)

卵巢癌是婦科常見腫瘤之一，術(shù)后化療是常用方法，鎵是繼鉑金屬類藥物之后第二個(gè)用于腫瘤治療的藥物。雖然在骨質(zhì)疏松方面有應(yīng)用[1-5]，但在腫瘤方面尚未廣泛應(yīng)用于臨床，國內(nèi)外少見報(bào)道。本研究通過硝酸鎵、順鉑單藥及聯(lián)合用藥組分別以不同濃度體外作用卵巢癌HO-8910細(xì)胞，探討硝酸鎵作用機(jī)制，為腫瘤治療及制備抗腫瘤藥物提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 硝酸鎵（Betapharma有限公司，上海，中國）；順鉑注射液（齊魯制藥有限公司）。人卵巢癌HO-8910細(xì)胞株（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將卵巢癌HO-8910細(xì)胞株復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞應(yīng)用。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 分成空白對照組、硝酸鎵組、順鉑組及硝酸鎵與順鉑聯(lián)合治療組。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25％胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1×105/mL，接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL。

1.4 蛋白的表達(dá)檢測 Western印跡法：將空白對照組和處理組（終濃度為：10 μg/mL的硝酸鎵，10 μg/mL的順鉑，5 μg硝酸鎵+10 μg順鉑/mL的聯(lián)合組作用72 h后，空白對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。）的細(xì)胞PBS清洗3次，加入裂解液（β巰基乙醇），冰上冷卻后，12 000 rpm離心2 min，取上清液，以Bradford方法在595 nm波長下測定。SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜切膠：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要按照蛋白的分子量，以Marker為對照進(jìn)行切膠。將切好的膠置于轉(zhuǎn)膠緩沖液中室溫?fù)u晃平衡30 min。備膜：裁剪硝酸纖維素膜和濾紙，與膠的大小相當(dāng)?shù)源?。戴手套切濾紙和膜。將切好的硝酸纖維素膜置于甲醇中放置15 s，使之從不透明變透明，然后放入超純水中2 min，最后將處理好的硝酸纖維素膜放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15 min。裝膜：將轉(zhuǎn)膜用的夾子打開使黑的一面（負(fù)極）保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。浸泡好的濾紙，隨后按照凝膠→硝酸纖維素膜→濾紙→海綿墊的順序依次疊放，注意每一層都不能有氣泡（如有氣泡可用玻璃棒輕輕搟壓）。最后將白色板（正極）蓋好裝入轉(zhuǎn)膜槽中。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。轉(zhuǎn)膜：將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會產(chǎn)熱，在槽的周圍放置冰來降溫。本實(shí)驗(yàn)室使用220 mA轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)完后將膜取下硝酸纖維素膜，標(biāo)記一角。封閉（將膜用TBST中漂洗3次，每次5 min。漂洗后將硝酸纖維素膜放入加有BSA封閉液的平皿中，室溫下?lián)u床2 h）。加一抗：將封閉后的硝酸纖維素膜放至含有TBST的洗缸中，搖床上漂洗3次，每次5 min。洗完后分別加入Bax抗體（1∶300）、Caspases-3（1∶150）、Bcl-2（1∶300）抗體及β-actin抗體（1∶1000），放入平皿中在側(cè)擺搖床上，室溫低速孵育2 h；加二抗：回收一抗，將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中室溫?fù)u床漂洗3次，每次5 min，然后將漂洗過的硝酸纖維素膜放至加有辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶800）的平皿中，室溫避光孵育1 h。孵育后將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中漂洗3次，每次5 min；化學(xué)發(fā)光，顯影，定影；凝膠圖像分析，采用Image J軟件分析處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（±s）表示，兩組比較采用作獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Western結(jié)果進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像分析，見表1、圖1。硝酸鎵組、順鉑組及聯(lián)合治療組HO-8910細(xì)胞Bcl-2的水平明顯低于空白對照組；Bax、Caspase-3的水平硝酸鎵組、聯(lián)合治療組明顯高于空白對照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而順鉑作用細(xì)胞Bax、Caspase表達(dá)變化不顯著。

表1 硝酸鎵作用72 h后Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果（±s）

表1 硝酸鎵作用72 h后Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果（±s）

*與空白對照組比較，P＜0.05；#與順鉑組比較，P＜0.05

?

圖1 各組蛋白表達(dá)注：1：空白對照組；2：順鉑組；3：硝酸鎵組；4：聯(lián)合治療組

3 討論

早期，人們將放射性鎵用于對腫瘤的定位及檢測腫瘤細(xì)胞生長代謝的活性。2004年美國FDA已審批硝酸鎵注射液作為non.Hodgkin的淋巴癌治療的Ⅱ期臨床。鎵是繼鉑金屬類藥物之后第二個(gè)用于腫瘤治療的藥物，但它比順鉑類藥物療效顯著且毒性小[6-9]，能有效地治療某些癌癥[10-11]。人們逐漸認(rèn)識到鎵的化療作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出鎵對腫瘤的定位。且相關(guān)藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床研究。

目前認(rèn)為鎵可能抗癌機(jī)制主要包括轉(zhuǎn)鐵蛋白受體途徑，研究發(fā)現(xiàn)在部分惡性淋巴瘤和膀胱癌中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)增高，硝酸鎵對于這種類型的腫瘤的治療效果明顯可能是通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體途徑抑制了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的活性，阻止鐵進(jìn)入細(xì)胞，致細(xì)胞內(nèi)鐵缺乏而導(dǎo)致核糖核苷酸還原酶鐵依賴M2亞單位活性降低，抑制了細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)[12-13]。

近年來，有關(guān)細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生，發(fā)展中的作用越來越受到重視細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡，腫瘤的發(fā)生與控制細(xì)胞增殖的癌基因的過度表達(dá)有關(guān)，也與抑制細(xì)胞凋亡基因的高表達(dá)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗癌基因變異失活有關(guān)細(xì)胞凋亡機(jī)制被不適當(dāng)?shù)亟K止是細(xì)胞癌變的重要前提，凋亡過程的受抑對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要作用，Caspase-3，Bax及Bcl-2是與癌發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)的3個(gè)指標(biāo)，Bcl-2基因是人體最主要的抗凋亡基因。它編碼的Bcl-2蛋白主要分布在線粒體外膜、細(xì)胞膜內(nèi)表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及核膜等處。Bcl-2抗凋亡的機(jī)制目前認(rèn)為主要有：（1）拮抗促凋亡基因bax；（2）抑制促凋亡的蛋白質(zhì)細(xì)胞色素c自線粒體釋放到胞質(zhì)；（3）阻止胞質(zhì)中的細(xì)胞色素c激活caspase；（4）有抗氧化及維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等作用；Bax基因?qū)儆贐cl-2基因家族，編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2 產(chǎn)生阻抑作用。研究發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2兩蛋白之間的比例關(guān)系是決定對細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素，因此認(rèn)為，Bax是極重要的促細(xì)胞凋亡基因一；Caspase-3通常以非活化的酶原形式存在于細(xì)胞中，只有當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)才被激活。活化的Caspase-3蛋白能使許多與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期及DNA修復(fù)相關(guān)的蛋白或激酶失活，是引發(fā)凋亡的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)中的核心蛋白酶[14]。所以，本次研究通過硝酸鎵體外作用卵巢癌HO-8910細(xì)胞，觀察三者蛋白水平表達(dá)變化，在分子層面分析鎵與腫瘤細(xì)胞的關(guān)系。

最新的研究發(fā)現(xiàn)鎵能夠引起淋巴瘤細(xì)胞凋亡是通過內(nèi)在的線粒體途徑。鎵通過激活Bax，破壞線粒體膜，釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)一步激活caspase-3[15-16]，進(jìn)而影響下游基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞生長繁殖。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)在此途徑進(jìn)行研究。

Western結(jié)果顯示，與正常對照組比較，硝酸鎵與順鉑對卵巢癌細(xì)胞在Bax、Caspase蛋白水平表達(dá)方面比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Western灰度值分別是Bax（0.5100±0.0022/0.4300±0.0011）、Caspase（0.3400±0.0016/0.2100±0.0003）；順鉑作用細(xì)胞Bax、Caspase表達(dá)變化不顯著，Western灰度值分別是Bax（0.4300±0.0011/0.4200±0.0021）、Caspase（0.2100±0.0003/0.2000±0.0013）而硝酸鎵組變化明顯，提示硝酸鎵可能通過激活Bax，破壞線粒體膜，釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)一步激活caspase-3的線粒體途徑方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，由于未做線粒體相關(guān)的其他實(shí)驗(yàn)，此作用效應(yīng)還需進(jìn)一步明確。順鉑非此通路作用，還可能與癌細(xì)胞本身此蛋白表達(dá)過低有關(guān)。

通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)以表明硝酸鎵在體外對HO-8910細(xì)胞有顯著的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，本實(shí)驗(yàn)在硝酸鎵作用下，卵巢癌細(xì)胞下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax蛋白，活化Caspase可能是其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制之一。

[1]Verron E， Masson M， Khoshniat S. Gallium modulates osteoclastic bone resorption in vitro without affecting osteoblasts[J]. British Journal of Pharmacology， 2010，159（8）：1681-1692.

[2]Chitambar C R， Purpi D P. A novel gallium compound synergistically enhances bortezomib-induced apoptosis in mantle cell lymphoma cells[J]. Leukemia Research ，2010，34（7）：950-953.

[3]趙俊杰，雷艷霞，李廣元，等.有機(jī)鎵對維甲酸致骨質(zhì)疏松大鼠骨骼中微量元素的影響[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2009， 30（3）：307-310.

[4]Lumachi F， Brunello A， Roma A. Cancer-induced hypercalcemia[J]. Anticancer Research ，2009，29（5）：1551-1555.

[5]Kaluderovic M R， Gomez Ruiz， Gallego B. Anticancer activity of dinuclear gallium （Ⅲ） carboxylate complexes[J]. European Journal of Medicinal Chemistry ，2010，45（2）：519-525.

[6]Francisco Silva， Fernanda Marques， Antonio Paulo， et al. Synthesis，characterization and cytotoxic activity of gallium （Ⅲ） complexes anchored by tridentate pyrazole-based ligands[J]. Journal of Inorganic Biochemistry ，2010，104（5）：523-532.

[7]Kowol C R， Berger R， Eichinger R， et al. Gallium （Ⅲ） and iron （Ⅲ）complexes of alpha-N-heterocyclic thiosemicarbazones： synthesis，characterization， cytotoxicity， and interaction with ribonucleotide reductase[J]. Journal of Medicinal Chemistry ，2007，50（6）：1254-1265.

[8]Harpstrite， Prior， Rath， et al. Metalloprobes： synthesis，characterization， and potency of a novel gallium （Ⅲ） complex in human epidermal carcinoma cells[J]. Journal of Inorganic Biochemistry，2007，101（10）：1347-1353.

[9]Yohan Suryo Rahmanto. Resistance to the antineoplastic agent gallium nitrate results in marked alterations in intracellular iron and gallium trafficking： identification of novel intermediates[J]. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics ，2006，317（1）：153-162.

[10]Harrington J R， Martens R J， Cohen N D， et al. Antimicrobial activity of gallium against virulent Rhodococcus equiin vitro and in vivo[J]. J Vet Pharmacol Ther，2006，29（2）：121-127.

[11]Chen D， Frezza M， Shakya R， et al. Inhibition of the proteasome activity by gallium （III） complexes contributes to their anti prostate tumor effects[J]. Cancer Res，2007，67（19）：9258-9265.

[12]Basar l， Ayhan A， Bircan K， et al. Transferrin receptor activity as a marker in transitional cell carcinoma of the bladder[J]. Br J Urol，1991，67（2）：165-168.

[13]Senderowicz A M， Reid R， Headlee D. et al. A Phase Ⅱ Trial of gallium nitrate in patients with androgen-metastatic prostate cancer[J]. Urol Int，1999，63（54）：120-125.

[14]Fan T J， Han L H， Cong R S， et al. Caspase family proteases and apoptosis[J]. Actaet Biophysica Sinica（Shanghai），2005，37（11）：719-27.

[15]Chitambar C R， Wereley J P， Matsuyama S. Gallium-induced cell death in lymphoma： role of transferrin receptor cycling， involvement of Bax and the mitochondria， and effects of proteasome inhibition[J]. Mol Cancer Ther，2006，5（11）：2834-2843.

[16]Chitambar C R， Purpi D P， Woodliff J， et al. Development of gallium compounds for treatment of lymphoma： gallium maltolate， a novel hydroxypyrone gallium compound induces apoptosis and circumvents lymphoma cell resistance to gallium nitrate[J]. J Pharmacol Exp Ther，2007，322（3）：1228-1236.

Effects of Gallium Nitrate on Protein Expression of Ovarian Cancer Cells

YANG Hong-mei， WANG Xuezhe.//Medical Innovation of China，2015，12（07）：025-027

Objective： To assess effect on ovarian adenocarcinoma cell HO-8910 by gallium nitrate， investigate the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3. Method： The human ovarian cancer cell line HO-8910 was cultured and treated with drugs， expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 was analyzed by Western blot. Result： The expression of Bcl-2 protein was down regulated in gallium nitrate group， cisplatin group and combination group compare with control. Bax and aspase-3 protein was activated in gallium nitrate group and combination group compare with control. Conclusion： Effects of gallium nitrate on human ovarian cancer cells， may be associating with the expression of Bcl-2 levels is decrease， Bax， Caspase are up regulation.

Gallium nitrate； Ovarian cancer cells； Expression of protein

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.07.008

2014-11-04） （本文編輯：王宇）

①遼寧省錦州市太和區(qū)醫(yī)院 遼寧 錦州 121001

②遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院

王學(xué)哲

First-author’s address： Taihe District Hospital of J inzhou City， J inzhou 121001， China