丙酮丁醇發酵過程關鍵酶活性研究*

王風芹，張瑞，謝瑤嬛，謝慧，宋安東

(河南農業大學生命科學學院，農業部農業微生物酶工程重點實驗室，河南鄭州，450002)

在當下全球能源危機、石化燃料供應不足、急需提高能源安全與多元化的背景下，丁醇作為一種極具競爭力的可再生生物燃料，快速引起了公眾與科學界的高度重視［1］。丁醇的4-C結構使其比乙醇具有更高的辛烷值和熱值［2］，可以有效提供更強勁的動力。丁醇還具有良好的抗爆性、安全性、融合性，被認為是最具有代替石化燃料潛在能力的新型燃料［3］。

丁醇發酵是利用梭狀芽胞桿菌屬微生物及其基因突變菌株在專性厭氧環境下，以淀粉、糖蜜、木質纖維素生物質水解產物、甘油、藻類生物質以及無機物作為基質發酵生產［1，4］。丁醇嚴格厭氧發酵存在菌株對氧氣敏感、菌體生長代謝緩慢、發酵工藝苛刻且繁瑣等不利因素，所以尋找新的可以在兼性厭氧條件下進行丁醇發酵的微生物菌株成為促進丁醇發酵產業化的有效途徑之一。本課題組從種植懷地黃的土壤中分離篩選到1株可以產丁醇的兼性厭氧芽孢桿菌(Bacillus sp.)C2菌株，其代謝產物主要包括丙酮、乙醇和丁醇，還有少量的甲酸、乙酸和丁酸。研究發現，Bacillus sp.C2可以在微氧環境下有效利用葡萄糖、淀粉和木質纖維素水解液發酵生產丁醇。本文對比研究了Bacillus sp.C2在嚴格厭氧和兼性厭氧條件下的丙酮丁醇發酵情況，并對兩種發酵條件下代謝途徑中關鍵酶活性變化進行檢測、對比分析。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:Bacillus sp.C2由本課題組從種植懷地黃土壤中分離、純化得到，于-80℃甘油管中保存;酶活性測定所需試劑購自Sigma公司。

1.2 培養基與緩沖液

活化培養基(5%玉米醪):100 mL水中加入5 g玉米粉調至呈糊狀，煮沸加熱5～8 min，并不斷攪拌，將制成的糊狀玉米醪液倒入試管中(9 mL/支)，121℃滅菌20 min。

發酵培養基(P2半合成培養基)(g/L):葡萄糖50.0，酵母提取物1.0，115℃滅菌20 min，冷卻后加入10 mL/L經0.22 μm微孔膜過濾的貯備溶液。貯備溶液(g/L):KH2PO450.0，K2HPO450.0，乙酸銨220.0;對氨基苯甲酸 0.1，VB10.1，VH0.001;MgSO4·7H2O 20.0，MnSO4·H2O 1.0，FeSO4·7H2O 1.0，NaCl 1.0［8］。

TE 25Suc緩沖液(L):102.7 g蔗糖，25mL 1mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，50mL 0.5 mol/L EDTA，NaOH調pH 8.0后定容至1 L待用。

1.3 丙酮丁醇發酵

1.3.1 菌種活化

以體積比為10%的接種量，將菌種接種到5% 的已滅菌玉米醪液體培養基試管中，在100℃沸水中熱激80 s后迅速放入涼水冷卻，37℃靜置培養48 h。

種子液制備:將已經充分活化后的菌種以體積比10%的接種量接種到300 mL三角瓶(含有200 mL P2培養基)中，放入普通恒溫培養箱37℃靜置培養24 h。

丁醇發酵:將制備好的種子液以體積比10% 的接種量接種到滅菌后的300 mL三角瓶/血清瓶(裝液量為270 mL，血清瓶中N2吹掃液面2 min去除氧氣后滅菌)中，恒溫培養箱中37℃靜置培養，每隔12 h取樣1次至發酵結束。

1.3.2 生物量、pH、溶解氧及溶劑的測定

菌體生物量:使用UV-722S分光光度計在600 nm處檢測其吸光值(OD);發酵液的pH值:PHS-4C酸度計室溫下測定;發酵液中溶解氧:重鉻酸鉀-三氯化鈦方法測定［9］。發酵產物乙醇、丙酮和丁醇利用Agilent 7890A氣相色譜儀進行檢測，色譜柱 HPFFAP(30 m × 0.32 mm × 1 μm);檢測器 FID(250℃);進樣量0.2 μL，進樣器溫度200℃;載氣N21.5 mL/min，H230 mL/min，空氣 350 mL/min。葡萄糖和有機酸利用Dionex P680高效液相色譜儀，離子排斥色譜柱Aminex HPX-87H，示差折光檢測器進行檢測。流動相0.005 mol/L H2SO4(pH2.0)，流速0.6 mL/min，柱溫55℃。

1.3.3 蛋白質提取

取樣發酵液2 mL，4℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液;0.1mol/L Tris-HCl緩沖液清洗菌體2～3次，離心條件如上述;之后加入200 μL TE 25Suc緩沖液將菌體懸浮(緩沖液中菌OD600值＞1.5)，加入50 μL溶菌酶緩沖液(10 mg/mL);放入37℃水浴中進行細胞破碎12～24 h，12 h后補加50 μL溶菌酶液;最后4℃、8 000 r/min離心10 min，上清液即為酶粗提液。利用核酸蛋白檢測儀(Thermo Scientific，Nanoprop1000)測定蛋白含量。

1.3.4 酶活性檢測

前期研究發現，Bacillussp.C2具有類似丙酮丁醇梭菌的丁醇代謝途徑［10］，因此研究了Bacillus sp.C2丁醇發酵過程中6種關鍵酶酶活性變化情況。包括乙醇脫氫酶(ethanol dehydrogenase)利用依賴NAD+/NADH將乙醛還原為乙醇的活性進行檢測［11］;丁醛脫氫酶(butylaldehyde dehydrogenase)，依據丁酰輔酶A還原為丁醛反應中NAD+的還原活性檢測和丁醇脫氫酶(butanol dehydrogenase)，依據丁醛還原為丁醇反應中NADP+(NAD+)的還原活性檢測［12］;乙酸激酶(acetate kinase，AK)，利用酶串聯分析法檢測ADP和異羥肟酸的形成，隨后進行 Fe3+著色反應來檢測 AK 酶活性［13］;丁酸激酶(butyrate kinase，BK)，利用丁酰磷酸和ATP在過量的羥胺環境中可以合成羥肟酸，然后用 Fe3+著色可以形成脫氫酶混合體來檢測BK活性［14］;乙酰乙酰輔酶A:乙酸/丁酸:輔酶A轉移酶(acetoacetyl-CoA transferase，ACT)，利用在ε310處檢測乙酰乙酰輔酶 A底物消失變化來測定CoA-T 活性［15］。

2 結果與分析

2.1 Bacillus sp.C2不同溶氧環境下生物量及pH值變化

Bacillus sp.C2在嚴格厭氧和兼性厭氧培養基中生長及pH值的變化見圖1。在三角瓶中進行兼性厭氧(facultative anaerobic，FA)發酵，其發酵液溶氧濃度(desovled oxygen，DO)由最初的4.6 mg/L降低到0.64 mg/L;血清瓶中進行嚴格厭氧(strictly anaerobic，SA)發酵，其發酵液DO含量從1.44 mg/L下降到0.24 mg/L。發酵前期(0～24 h)，嚴格厭氧條件下菌體生長速率略高于兼性厭氧條件，然而兼性厭氧條件下發酵液OD600最大值為2.945高于嚴格厭氧條件下的2.793。發酵前期(0～24 h)，專性厭氧條件下發酵液pH值下降速率顯著高于兼性厭氧，發酵36 h后pH緩慢回升。

圖1 不同條件下培養基中pH值、生物量及溶解氧變化Fig.1 Changes of biomass，pH value and dissolved oxygenin different condition medium

2.2 Bacillus sp.C2發酵結果

Bacillus sp.C2在兼性厭氧與專性厭氧條件下葡萄糖利用速率及產溶劑和有機酸結果如圖2所示。葡萄糖初始濃度為47.3 g/L，發酵84 h之后葡萄糖完全利用，發酵前期(72 h)專性厭氧條件下葡萄糖利用速率高于兼性厭氧，而發酵后期兼性厭氧葡萄糖利用速率高于專性厭氧。發酵96 h總溶劑產生進入穩定期，丁醇、丙酮、乙醇在兼性厭氧和嚴格厭氧條件下最高產量分別為 9.50、2.63、0.89 g/L 和8.52、2.48、0.74 g/L，其丁醇得率分別為0.201和0.180 g/g。丁醇產量在兼性厭氧比嚴格厭氧條件下高11.50%，總溶劑產量高9.01%(圖2A，2B)。

圖2 兼性厭氧(A，C)和專性厭氧(B，D)條件下溶劑、酸的產量及葡萄糖質量濃度Fig.2 Concentration of butanol，acetone，ethanol，acids and glucose consumed under facultative anaerobic(A，C)and strictly anaerobic(B，D)condition

乙酸、丁酸作為丁醇代謝途徑中的重要中間產物，對丁醇的產生有巨大的影響。Clostridium acetobutylicum丁醇發酵過程產酸階段未解離酸類物質累積過快將導致發生“Acid Crash”現象，其中甲酸是引起該現象最主要的原因［16-17］。Bacillus sp.C2在兼性厭氧和嚴格厭氧條件下發酵產生酸類物質的變化情況如圖(2C、2D)。兼性厭氧發酵時甲酸、乙酸、丁酸在0～12 h階段急劇增加，最大值分別為0.288、2.398和2.295 g/L;之后由產酸階段轉入產溶劑階段，甲酸、丁酸含量逐漸下降，乙酸含量維持2.4 g/L左右。嚴格厭氧條件發酵顯示甲酸、乙酸和丁酸分別在12、36和24 h達到最大值0.137 9、3.142和2.521 g/L。結果對比發現嚴格厭氧比兼性厭氧條件下發酵產酸階段時間延長，丁酸和乙酸含量分別高出9.69%和31.02%。總體來說，Bacillus sp.C2在兼性厭氧比之嚴格厭氧條件下發酵產生的溶劑量高出9.01%，酸類的總含量卻低10.99%。

2.3 關鍵酶活性分析

丁醇發酵過程中12～72 h細胞內關鍵酶酶活性變化檢測結果如圖3所示。乙醇脫氫酶是乙醇途徑中依賴NAD+將乙醛氧化還原為乙醇的關鍵酶，其酶活性在嚴格厭氧和兼性厭氧條件下存在顯著差異(圖3A)。在發酵初期12 h產酸階段，嚴格厭氧條件下的菌體胞內乙醇脫氫酶活性已經達到最高值1.766 U/mg，比兼性厭氧條件下的菌體胞內酶活性高21.29%，之后嚴格厭氧條件下的乙醇脫氫酶酶活性開始下降，兼性厭氧條件乙醇脫氫酶活性逐漸上升，并在36 h達到最大值1.752 U/mg。整個酶活性變化過程分析可知，發酵36 h之前嚴格厭氧發酵菌體胞內乙醇脫氫酶活性由大到小的變化，而兼性厭氧發酵胞內酶活性由小到大的變化，導致嚴格厭氧發酵初期乙醇的產生速率高于兼性厭氧發酵;但是從36 h后兼性厭氧發酵菌體胞內乙醇脫氫酶酶活性高于嚴格厭氧發酵乙醇脫氫酶活性，并且兼性厭氧條件下胞內乙醇脫氫酶酶活性維持時間長、下降速率小;這期間乙醇產生速率加快，最后乙醇產量兼性厭氧比嚴格厭氧發酵高出18.99%。

丁醇脫氫酶和丁醛脫氫酶是丁醇產生途徑的關鍵酶，丁醛脫氫酶依賴NAD+作用于丁酰輔酶A轉化為丁醛，然后丁醇脫氫酶依賴于NADP+作用于丁醛使其轉化為丁醇。此二者酶活性的高低、酶活性保持時間的長短直接影響到丁醇的產量。如圖3B、3C所示，發酵初期12 h，嚴格厭氧條件二者酶活性分別1.169和0.131 U/mg，分別高出兼性厭氧條件下丁醇脫氫酶和丁醛脫氫酶4.09%和18.01%，此后兩種酶活性隨發酵時間的延長逐漸降低。發酵12 h后兼性厭氧條件下的丁醇脫氫酶和丁醛脫氫酶酶活性開始增長，并在36 h達到最高值，酶活性分別為1.272和0.132 U/mg，比嚴格厭氧分別高 12.4%和12.8%。此現象與乙醇脫氫酶活性變化規律一致。發酵結束后測得丁醇產量數據顯示，兼性厭氧發酵比嚴格厭氧發酵丁醇產量提高11.50%(圖3B、3C)。

圖3 Bacillus sp.C2在兼性厭氧與嚴格厭氧條件下6種關鍵酶活性變化Fig.3 Changes of Bacillus sp.C2 about six kinds of key enzyme activity under facultative anaerobic and strictly anaerobic condition

輔酶A轉移酶是丙酮支路的關鍵酶，也是乙酸逆向生成乙酰輔酶A和丁酸逆向代謝生成丁酰輔酶A過程中的關鍵酶。當發酵液中乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽累積生成并作為基質的時候，CoA T的活性開始增長至最大值［18-19］。若是菌體細胞內缺乏CoA T表達活性，將導致溶劑丁醇產量的降低或者沒有丁醇產生，CoA T活性缺乏的菌株大多數伴隨著丁醇脫氫酶活性的缺乏［15］。如圖3 D中嚴格厭氧發酵菌體胞內CoA T的活性在12 h達到最高值2.47 U/mg，隨后逐漸下降;兼性厭氧發酵菌體胞內CoA T的活性在整個檢測范圍內先升高后降低，最高點在36 h的2.48 U/mg。兼性厭氧條件下CoA T的活性明顯比嚴格厭氧條件下酶活性保持時間久，直接導致兼性厭氧條件丙酮產量高于嚴格厭氧條件丙酮產量6.1%。分析乙酸和丁酸產量變化(圖2C、2D)發現丁酸存在逆向重復吸收利用的現象，可以推測CoA T活性高低是丙酮合成與酸類物質逆向轉化吸收重要的因素之一，特別是在丁酸逆向轉化為丁酰輔酶A后再經過丁醇脫氫酶/丁醛脫氫酶轉化生成丁醇途徑起到的作用更加明顯。

乙酸激酶和丁酸激酶分別作用于乙酰磷酸去磷酸化和丁酰磷酸去磷酸化產生乙酸和丁酸，同時產生能量ATP［20］。乙酸和丁酸的累積會通過上述CoA T的作用進行重復吸收分別轉化為乙酰輔酶A和丁酰輔酶A，它們分別是乙醇和丁醇合成途徑中重要的中間代謝物。圖3E、圖3F分別是Bacillus sp.C2菌株在嚴格厭氧和兼性厭氧發酵過程中乙酸激酶和丁酸激酶的變化趨勢圖。嚴格厭氧條件下的乙酸激酶和丁酸激酶活性在檢測范圍初期(12 h)分別為0.251和0.301 U/mg，比兼性厭氧高31.3%和77.1%，隨著發酵的繼續兼性厭氧條件酶活性開始上升，發酵24 h達到最高值，此時的酶活性超越嚴格厭氧條件下的酶活性。對照乙酸和丁酸產量變化亦可發現，嚴格厭氧比之兼性厭氧條件乙酸和丁酸的產量高。

3 討論

目前報道的丁醇產生菌多數均為專性厭氧的梭狀芽孢桿菌，主要是 C.beijerinckii、C.acetobutylicum、C.saccharoperbutylacetonicum、C.saccharobutylicum4個種［21-22］。專性厭氧發酵對儀器設備有著嚴格的要求，加大了丁醇生產的成本。另外對于專性厭氧微生物來講，氧氣的存在對微生物的生長、代謝途徑、底物消耗和產物產生均帶來負面影響。早在20世紀30年代Kanysi和Dutky已經研究了氧氣對丁醇產生菌的影響，發現氧氣的存在下菌體生長受到嚴重抑制［23］。此后 O’Brien和 Morris同樣研究了氧氣對C.acetobutylicum生長和代謝的影響，發現當氧氣的含量上升到一定值，底物消耗速率明顯降低，菌體體內DNA、RNA和蛋白質的合成終止，還會導致芽孢形成的加劇［24］。因此，提高丁醇發酵菌株對氧氣的耐受能力是降低丁醇發酵成本、優化發酵工藝、提高發酵產物量及促進丁醇工業化發酵的關鍵突破點之一。

王少華等［25］研究了利用氧氣控制發酵培養基氧化還原電位對Clostridium acetobutylicum DSM 1731丁醇發酵的影響，結果發現控制不同值的氧化還原電位導致不一樣發酵結果，特別是控制氧化還原電位在-290 mV溶劑總產量比對照組提高了35%，同時分析代謝流顯示溶劑化階段提前，發酵前24 h的碳代謝流明顯增強。碳代謝流的增強影響乙酰輔酶A、乙酰乙酰輔酶A和丁酰輔酶A等中間代謝物累積，而它們又是乙醇、丙酮和丁醇產生的前體，因此在適當的氧化還原電位值可以促進細胞碳代謝流從而提高溶劑的產生。Kim 等［26］對 Clostridium acetobutylicum ATCC 824關于不同值的氧化還原電位發酵研究也得出類似論點，當選擇一個適當氧化還原電位值丁醇的產量可能會明顯提高。

本研究中Bacillussp.C2在兼性厭氧條件下發酵產生溶劑量高于嚴格厭氧發酵產生溶劑量的11.5%。對不同溶氧量條件下的關鍵酶活性檢測對比分析發現，兼性厭氧比嚴格厭氧條件下酶活性高，在酶活性保持時間方面也有明顯的提高，丁醇產量高。為今后的工作提出了新的研究方向，探索Bacillus sp.C2最佳的發酵溶氧量，然后確定其合適丁醇發酵的氧化還原電位值;分析在不同溶氧條件下細胞代謝通量的變化及差異，期望能促進關鍵酶高效表達，提高溶劑產量。

4 結論

通過對Bacillus sp.C2在不同溶氧條件下發酵試驗結果整理分析得出，在兼性厭氧條件下發酵產生總溶劑和丁醇分別是13.02和9.50 g/L，丁醇的得率為0.201 g/g;嚴格厭氧條件下發酵產生總溶劑和丁醇分別是11.74和8.53 g/L，丁醇的得率為0.180 g/g;兼性厭氧比嚴格厭氧條件下總溶劑和丁醇分別提高11.50%和9.01%。關鍵酶活性結果對比分析發現，在發酵延滯期兼性厭氧條件下乙醇脫氫酶、丁醇脫氫酶、丁醛脫氫酶、乙酰乙酰輔酶A轉移酶乙酸激酶、丁酸激酶活性低于嚴格厭氧條件下其酶活性。然而隨著發酵時間的延長，當發酵時間到24 h之后，兼性厭氧條件下的酶活性逐步超越嚴格厭氧條件酶活性且持續增長至36 h后開始緩慢降低，并且兼性厭氧比嚴格厭氧條件下酶活性保持時間較長有利于溶劑產生。

［1］ Jang Y S，Malaviya A，Cho C，et al.Butanol production from renewable biomass by Clostridia ［J］.Bio Resource and Technology，2012，123(20):653-663.

［2］ JIN Chao，YAO Ming-fa，LIU Hai-feng，et al.Progress in the production and application of n-butanol as a biofuel［J］.Renewable and Sustainable Energy Reviews，2011，15(8):4 080-4 160.

［3］ 段曉瑞，王根宇，劉宏娟，等.兼性厭氧芽胞桿菌 TSH1丁醇代謝途徑中關鍵酶的檢測［J］.生物工程學報，2013，29(5):620-629.

［4］ Jones D T，Woods D R.Acetone-butanol fermentation revisited ［J］.Microbiology Reviews，1986，50(4):484-524.

［5］ Qureshi N，Ezeji T C，Ebener J，et al.Butanol production by Clostridium beijerinckii.Part I:use of acid and enzyme hydrolyzed corn fiber ［J］.Bioresource and Technology，2008，99(13):5 915-5 922.

［6］ ZHENG Y N，LI L Z，XIAN M，et al.Problems with the microbial production of butanol［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2009，36(9):1 127-1 138.

［7］ LAN E I，LIAO J C.Metabolic engineering of Cyanobacteriafor 1-butanol production from carbon dioxide［J］.Metabolic Engineering，2011，13(4):353-363.

［8］ Dhamole P B，WANG Z L，LIU Y Q，et al.Extractive fermentation with non-ionic surfactants to enhance butanol production［J］.Biomass and Bioenergy，2012，40(5):112-119.

［9］ 楊積晴.重鉻酸鉀-三氯化鈦法測定水中溶解氧［J］.環境監測管理與技術，1996，8(5):23-24.

［10］ 王風芹，謝慧，楚樂然.產丁醇芽孢桿菌的分離、篩選與鑒定［J］.微生物學通報，2010，37(1):7-11.

［11］ Stephen F H，ZHU C X.Butanol-ethanol dehydrogenase and butanol-ethanol-isopropanol dehydrogenase:different alcohol dehydrogenases in two strains of Clostridium beijerinckii(Clostridiumbutylicum)［J］.Applied and Environment Microbiology，1987，53(4):697-703.

［12］ Diirre P，Kuhn A，Gottschalk G.Treatment with allyl alcohol selects specifically for mutants of Clostridium acetobutylicum defective in butanol synthesis［J］.FEMS Microbiology Letters，1986，36(1):77-81.

［13］ Aceti D J，Ferry J G.Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcinathermophila-Evidence for regulation of synthesis［J］.Journal of Biological Chemistry，1988，263(30):15 444-15 448.

［14］ Rose I A.Acetate kinase of bacteria(acetokinase)［J］.Methods in Enzymology，1955，1:591-593.

［15］ Sandra W C，George N B，Frederick B R.Isolation and characterization of mutants of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 deficient in acetoacetyl-coenzyme A:acetate/butyrate:coenzyme A-transferase(EC 2.8.3.9)and in other solvent pathway enzymes［J］.Applied and Environment Microbiology，1989，55(4):970.

［16］ Maddox I S，Steiner E，Hirsch S，et al.The cause of“Acid Crash”and“Acidogenic Fermentations”during the batch acetone-butanol-ethanol(ABE)fermentation process［J］.Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology，2000，2(1):95-100.

［17］ WANG S，ZHANG Y，DOMG H，et al.Formic acid triggers the“Acid Crash”of acetone-butanol-ethanol fermentation by Clostridiumacetobutylicum［J］.Applied and Environment Microbiology，2011，77(5):1 674-1 680.

［18］ Weisenborn D P，Rudolph F B，Papoutsakis E T.Coenzyme A transferase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and its role in the uptake of acids［J］.Applied and Environment Microbiology，1989，55(2):323-329.

［19］ Cary J W，Petersen D J，Papoutsakis E T，et al.Cloning and expression of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 acetoacetyl-coenzyme A:acetate/butyrate:coenzyme A-transferase in Escherichia coli［J］.Applied and Environment Microbiology，1990，56(6):1576.

［20］ Wouter K，Nigel P M，Ana M L，et al.Disruption of the acetate kinase(ack)gene of Clostridium acetobutylicum results in delayed acetate production［J］.Applied and Microbiology Biotechnology，2012，3(94):729-741.

［21］ Keis S，Shaheen R，Jones D T.Emended descriptions of Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii，and descriptions of Clostridium saccharoperbutylacetonicum sp.nov.and Clostridium saccharobutylicum sp.nov.［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2001，51(6):2 095-2 103.

［22］ Papoutsakis E T.Engineering solventogenic Clostridia［J］.Current Opinion in Biotechnology，2008，19(5):420-429.

［23］ Kanysi G，Dulky S R.The growth of a butanol Clostridium in relation to the oxidation-reduction potential and oxygen content of the medium［J］.Journal of Bacteriology，1936，31(2):137-149.

［24］ O’Brien R W，Morris G.Oxygen and the growth and metabolism of Clostridium acetobutylicum［J］.Journal of General Microbiology，1971，68(1):307-318.

［25］ WANG S，ZHU Y，ZHANG Y，et al.Controlling the oxidoreduction potential of the culture of Clostridium acetobutylicumleads to an earlier initiation of solventogenesis，thus increasing solvent productivity［J］.Applied and Microbiology Biotechnology，2012，93(3):1 021-1 030.

［26］ Kim J，Rakesh B，Eugene L I.Redox potential in acetone– butanol fermentations［J］.Applied and Biochemistry Biotechnology，1988，18(1):175-186.