微生物發(fā)酵法生產(chǎn)去氫表雄酮檢測方法的建立*

張磊，靳魁奇，劉宇鵬

(河南大學生命科學學院生物工程研究所，河南開封，475004)

去氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，以下簡稱DHEA)是一種C19類固醇甾體化合物，具有抗炎、增殖及抭抑郁等活性，其衍生物能促進動物免疫應答。此外，它還是合成甾體藥物的重要中間體。現(xiàn)在DHEA的生產(chǎn)大多采用化學合成，原料價格昂貴，反應過程復雜，對環(huán)境危害大。因而，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHEA成為一種理想的生產(chǎn)方法。其主要反應流程如圖1所示:先通過化學反應將混合植物甾醇(多為甾醇的混合物，主要成分包括菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和豆甾醇)3-位羥基保護，生成植物甾醇保護物，再利用微生物發(fā)酵生成去氫表雄酮甲氧基甲基醚，經(jīng)過水解，可得到 DHEA［1］。

圖1 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHEA反應流程圖Fig.1 The reaction scheme for DHEA production by microbial fermentation

文獻報道的植物甾醇類物質(zhì)的分析方法主要有薄層層析法(TLC)［2］、氣相色譜法［3-4］、紫外可見光分光光度法［5-6］以及高效液相色譜法(HPLC)［7］。其中，TLC只能根據(jù)斑點的大小和顏色的深淺判斷各組分的大致比例，靈敏度和準確度較低，無法確定它們的精確含量;紫外可見光分光光度法干擾因素多，靈敏度不高;HPLC易受流動相成分、比例和樣品處理方法等影響，且有DHEA、植物甾醇、植物甾醇保護物和去氫表雄酮甲氧基甲基醚的響應值較小等缺點。

目前，國內(nèi)還未見氣相色譜同時檢測DHEA、植物甾醇保護物和去氫表雄酮甲氧基甲基醚的報道。本文采用氣相色譜內(nèi)標法，試圖建立一種同時測定DHEA、植物甾醇、植物甾醇保護物、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和發(fā)酵副產(chǎn)物雄甾烯二酮(4-Androstene-3，17-dione，4-AD)的方法。這種方法分離效果較好，簡化了樣品的預處理步驟，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHEA的優(yōu)化和生產(chǎn)過程的分析與控制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器及色譜條件

1.1.1 儀器

島津GC-2014C氣相色譜儀;FID檢測器、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用循環(huán)泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;RF-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;VORTEX KB3漩渦振蕩儀、GL-3250B磁力攪拌器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;QHZ-98A全溫度振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠。

1.1.2 色譜條件

色譜柱:DB-1(30 m ×0.53 mm ×0.25 μm)毛細管柱;載氣:氮氣1 mL/min;進樣口溫度:280℃;檢測器溫度:310 ℃。進樣量:2 μL，分流比 20∶1。

1.2 材料及試劑

1.2.1 材料

標準品DHEA，4-AD(Sigma公司);菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和豆甾醇的標準品(Sigma公司);混合植物甾醇(上海金穗生物科技有限公司，純度95%);標準品植物甾醇保護物，去氫表雄酮甲氧基甲基醚(實驗室自制);角鯊烷(上海金穗生物科技有限公司)。以上標準品均為分析純。

1.2.2 試劑

乙酸乙酯、甲醇、甲縮醛、P2O5、硅藻土，均為分析純。

1.2.3 供試菌株和培養(yǎng)基

分枝桿菌(Mycobacterium sp.NRRLB-8128)。

種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 10，酵母膏 10，NaNO35，NaH2PO45，Na2HPO45，甾醇保護物 10，大豆油160 mL。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液

精確稱取DHEA標準品0.05 g，置于50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為1.00 g/L的標準品貯備液，精密吸取20、15、10、5 mL標準品貯備液分別置于25 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，得到梯度濃度的DHEA標準品溶液。

同理，配制梯度質(zhì)量濃度(1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 g/L)的去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD標準品溶液。

待測樣品加入50 μL(1 μL/mL)角鯊烷作為內(nèi)標物，得到待測樣品。

1.3.2 植物甾醇3位羥基的保護反應

稱取一定量的混合植物甾醇，置于裝有適量硅藻土和甲縮醛溶液的圓底燒瓶內(nèi)，攪拌。待甾醇完全溶解后，加入適量的P2O5，繼續(xù)攪拌。等混合植物甾醇完全轉(zhuǎn)化后，趁熱過濾，濾餅和圓底燒瓶用甲縮醛清洗。減壓濃縮之后，用1%K2CO3清洗，甩濾，水洗，60℃烘干，得到淡黃色固體，即為植物甾醇保護物。

1.3.3 植物甾醇保護物發(fā)酵工藝

種子培養(yǎng):31℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)40～48 h。

發(fā)酵培養(yǎng):待種子生長到對數(shù)生長期，按20%接種量接入500 mL發(fā)酵搖瓶，31℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。

1.3.4 DHEA提取與純化

見文獻［1］。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

植物甾醇、植物甾醇保護物、去氫表雄酮甲氧基甲基醚、4-AD以及DHEA均系弱極性物質(zhì)，常采用AC-5型色譜柱，SE-54型分析［8-10］。本文采用的是DB-1型(30 m ×0.53 mm ×0.25 μm)毛細管柱(非極性，高效柱)，DHEA、植物甾醇、植物甾醇保護物、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD得到有效分離，色譜圖見2。

圖2 甾體化合物標準品色譜圖Fig.2 Gas chromatorgram of the sterol standards

由圖2可知，標準品植物甾醇中各組分(菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和豆甾醇)保留時間分別為12.869、13.011、13.380、14.400 min;植物甾醇保護物中各組分對應(菜籽甾醇保護物、菜油甾醇保護物、β-谷甾醇保護物和豆甾醇保護物)的保留時間為15.388、15.657、16.042、17.383 min;DHEA、4-AD、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和角鯊烷的保留時間分別為6.301、6.956、7.171、7.286 min。

2.2 線性關(guān)系實驗

按照1.3.1中標準溶液的制備方法配制溶液，取2 μL進樣。根據(jù)峰面積(Y)和濃度(X)關(guān)系繪制標準曲線。各組分濃度線性范圍、回歸方程以及相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表1。從表1看出，DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD各組分在其各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD各組分的線性關(guān)系Table 1 Linear correlation of DHEA、3β-methoxymethy L-ether-dehydrepiandrosterone and 4-AD

2.3 回收率實驗

取50 mL空白發(fā)酵液，分別加入標樣DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD為0.500 g，采用與待測樣品相同的預處理方法，重復進樣5次。結(jié)果見表2。

表2 標準樣品的回收率(n=5)%Table 2 Recovery of the standard samples(n=5)%

2.4 分析方法的精密度

精密吸取標準溶液2.00 μL，分別重復進樣5次，計算DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD的相對標準偏差RSD分別0.84%、0.65%、1.22%。

2.5 重現(xiàn)性實驗

取同一個發(fā)酵液樣品，按1.3.4所述方法對樣品進行處理，重復測定樣品5次，DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD均含量的RSD分別是2.87%、1.83%、1.72%，說明建立的氣相色譜內(nèi)標分析方法重現(xiàn)性良好。

2.6 檢測方法專屬性的評價

取未加入植物甾醇保護物的空白發(fā)酵液，同樣操作進行測定，色譜圖顯示，基線基本水平，無明顯出峰，可見空白發(fā)酵液中無其他雜質(zhì)干擾，此方法專屬性較好。

2.7 樣品中發(fā)酵產(chǎn)物的測定

取5批不同發(fā)酵液，按1.3.4方法處理。進氣相檢測，色譜結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵液樣品氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of the fermentation broth

圖4 發(fā)酵液水解液氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatogram of the hydrolysate of fermentation broth

由圖4可以看出，底物植物甾醇保護物基本上轉(zhuǎn)化完全。然后，按照上述各自對應的線性關(guān)系，得出5批發(fā)酵液水解液中DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD各自含量。定量結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵液水解后樣品的測定結(jié)果Table 3 The determination results of the sample by hydrolysis of fermentation broth

3 結(jié)論

本研究以角鯊烷為內(nèi)標，乙酸乙酯為萃取劑，建立了氣相色譜內(nèi)標法測定分枝桿菌(Mycobacterium sp.NRRLB-8128)發(fā)酵液中DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD的含量。DHEA在0.2～1.0 g/L范圍內(nèi)R2=0.998;去氫表雄酮甲氧基甲基醚在0.1～0.9 g/L范圍內(nèi)R2=0.992;4-AD在0.2～1.0 g/L范圍內(nèi)R2=0.998，線性關(guān)系良好。平均回收率依次為(97.88±0.74)%，(99.39±1.07)%，(98.91±1.09)%，精密度和準確度較好，符合分析的要求，能夠滿足檢測工作的要求。

實驗結(jié)果表明采用氣相色譜法(GC)測定發(fā)酵液中DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD的含量，其選擇性好，分離效果高，靈敏度高，分析速度快，大大簡化了實驗操作過程，非常適合于微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)DHEA過程中底物及產(chǎn)物的及時分析與監(jiān)測。

［1］ 劉喜榮，孟浩，楊坤.用微生物發(fā)酵制備去氫表雄酮的方法:中國，102816825 A［P］.2012.12.12.

［2］ Marsh A，Clark B，Altria K.Oil-in-water microemulsion high performance liquid chromatographic analysis of pharmaceuticals［J］.Chromatographia，2004，59(9-10):531-542.

［3］ LIU R，ZHOU J L，Wilding A.Simultaneous determination of endocrine disrupting phenolic compounds and steroids in water by solid-phase extraction–gas chromatography–mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2004，1 022(1):179-189.

［4］ Onuchak L A，Kudryashov S Y，Arutyunov Y I，et al.Influence of flow parameters of the mobile phase on the retention and thermodynamic characteristics of sorption in gas-liquid chromatography［J］.Russian Journal of Physical Chemistry，2006，80(8):1 315-1 320.

［5］ 許文林，沙鷗，錢俊紅，等.混合甾醇中 β-谷甾醇和豆甾醇的紫外光譜法分析測定［J］.光譜學與光譜分析，2003，23(5):933-936.

［6］ 劉倩，陳鈞，仰榴青.南沙參中 β-谷甾醇的分光光度法測定［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，35(12):748-750.

［7］ Tsuruta Y，Teranishi T，Date Y，et al.Simultaneous determination of cholesterol and cholestanol in human serum by high-performance liquid chromatography using 3-(5，6-methylenedioxy-2-phthalimidyl)benzoyl azide as precolumn fluorescent labelling reagent［J］.Journal of Chromatography B:Biomedical Sciences and Applications，1993，617(2):213-220.

［8］ 楊英，姜紹通，趙俊平，等.微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇為雄烯二酮檢測方法的建立［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，34(11):152-155.

［9］ 陳瀅，申雁冰，孟婧垚，等.氣相色譜法測定植物甾醇發(fā)酵液中雄甾烯酮和植物甾醇的含量［J］.天津科技大學學報，2008，23(1):17-20.

［10］ 陳茂彬，吳謀成.植物甾醇的毛細管氣相色譜分析方法研究［J］.中國糧油學報，2005，19(6):88-90.