馬黛茶多酚加壓毛細管電色譜法的定量分析*

趙琪，臧曉韻，胡海峰

1(中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院，創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海，200040)

2(上海農業科學院，上海，201106)

馬黛茶，又名巴拉圭茶(Ilex paraguariensis)，屬冬青科冬青屬，原產于南美，由南美洲獨有的馬黛樹葉精制而成，與咖啡、茶(紅茶和綠茶)并稱“世界三大茶”［1-2］。其具有較強的抗氧化、抗癌、保護心腦血管、減肥、消炎和免疫調節等活性［3］，受到了許多國家的關注，我國也于2004年將馬黛茶凈油或提取物列入食品用香料名單［4］。其中，多酚是巴拉圭茶的主要活性成分［5-7］，主要是綠原酸類物質包括綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C，以及少量的槲皮素、蘆丁、山奈酚等黃酮類物質［8-9］，而非中國傳統茶葉所含的兒茶素類物質。目前，關于馬黛茶多酚的分析檢測方法主要有比色法、TLC、HPLC、HPLC-ESI/MS 等方法［4，9-11］。

加壓毛細管電色譜(pCEC)是一種新興的微分離技術，與傳統的分析手段相比，具有高柱效、高選擇性、分析速度快、試劑和樣品消耗少等突出優點［12］，近幾年開始也用于中藥活性成分分析［13］，并顯現出極大的優勢。而目前采用pCEC對馬黛茶多酚的分析及定量研究國內外均未見報道。本研究建立了應用pCEC定量分析馬黛茶中4種多酚類化合物的新方法，以期建立一種高效、低耗、準確的馬黛茶多酚的分析方法，從而完善了馬黛茶的質量標準研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

TriSepTM-2100加壓毛細管電色譜儀(上海通微分析技術有限公司)，包括2臺高壓輸液模塊，微流控模塊，可變波長紫外檢測器(190～800 nm)，高壓電源模塊(±30 kV);KH-500B型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司);實驗pH計(梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司);Waters 515高效液相色譜。

新綠原酸(1，批號 130629)、綠原酸(2，批號131101)、異綠原酸 A(3，批號130919)、異綠原酸C(4，批號130920)的對照品，上海遠慕生物科技有限公司，純度≥98%;馬黛茶A(巴西原裝伯隆馬黛茶，1 000g)、馬黛茶B(伯隆馬黛茶焦香型，2g/袋)、馬黛茶C(伯隆經典原味袋泡茶，2g/袋)，上海伯隆食品有限公司;乙腈(色譜純)，上海人民化工廠;水為娃哈哈純凈水;H3PO4、氨水(分析純)，上海試劑一廠;其他試劑均為分析純，上海國藥集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備

供試樣品的制備［4］:將馬黛茶A低溫干燥后，粉碎成粗粉(過60目篩)，稱取干燥的馬黛茶A粉末1.000g，加入10 mL體積分數70%乙醇，80℃下加熱回流90 min，抽濾，用70%乙醇定容于50 mL容量瓶，經0.22μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。

對照品的制備:分別精密稱取1～4對照品各6.0、4.0、6.0、14.0 mg，加入流動相定容于5 mL 容量瓶中制成對照品貯備液。使用時根據需要用流動相稀釋至相應的濃度。

1.2.2 色譜條件

1.2.2.1 pCEC色譜條件

毛細管填充柱(EP-100-20/45-3-C18，內徑100μm，毛細管全長 45 cm，有效長度 20 cm，ODS填料粒徑3 μm)購于蘇州環球色譜責任有限公司;流動相A:10%甲醇+磷酸(pH 2.5，2 mmol/L);流動相B:乙腈;檢測波長:325 nm;泵總流速:0.07 mL/min;電壓:-10 kV。其梯度洗脫程序見表1。

表1 pCEC梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program of pCEC

1.2.2.2 HPLC 色譜條件［4］

色譜柱 phenomenexC18(5μm，250mm ×4.6mm);流動相A:10%乙腈+0.1%磷酸;流動相B:乙腈。其梯度洗脫程序見表2。

表2 HPLC梯度洗脫程序Table 2 The gradient elution program of HPLC

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相的選擇

由于多酚類化合物的酚羥基、羧基在水溶液中容易發生電離，極性增強，在固定相表面形成雙重保留，色譜峰發生拖尾，加入少量的酸性調節劑可以抑制多酚電離，減弱其在色譜柱的保留行為，從而改善峰形［14］，故實驗選取甲酸、乙酸和磷酸3種常見的酸性調節劑考察。(圖1)

圖1 馬黛茶多酚的pCEC條件優化圖譜Fig.1 The optimized chromatogram of Mate tea polyphenols by pCEC

結果表明，甲酸或乙酸作為改性劑時，各峰的峰 形不好，且分辨率較低;改用磷酸作為酸改性劑調節流動相的pH時，峰形、分辨率、靈敏度都獲得較大的改善，故選擇磷酸作為酸改性劑進行后續實驗。實驗還調節了酸性調節劑的pH(2.5～5.5)和離子強度(2～16mmol/L)，結果如圖1所示。綜合考慮分離度和分離時間，最終選擇乙腈和磷酸(pH=2.5，2mmol/L)作為流動相。

2.1.2 分離電壓的選擇

在加壓毛細管電色譜中，適當的高電壓能夠增加電滲流速度進而縮短帶電物質保留時間，從而縮短分析時間。實驗考察-7、-10、-13、-16 kV電壓對分離的影響。結果表明，隨著分離電壓的增大，分析時間縮短。但是當分離電壓高于-10 kV時，峰分離度變差。因此，選用分離電壓為-10 kV為最優電壓。

2.1.3 最優色譜條件

具體色譜條件同1.2.2.1，色譜圖結果見圖2。

2.1.4 線性范圍與檢出限和定量限

分別量取對照品溶液 2、1、0.5、0.25、0.125 mL，各置2 mL容量瓶中，加流動相定容搖勻，得一系列梯度的標準混合溶液，按最優pCEC色譜條件進行測定。以對照品的質量濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標進行線性回歸，得到4種馬黛茶多酚的回歸方程、線性范圍、相關系數、檢出限和定量限如表3所示。

圖2 馬黛茶提取物(A)及對照品(B)的pCEC圖譜Fig.2 pCEC chromatograms of Mate Teaextact and standard substance

表3 線性方程、線性范圍、相關系數及檢出限Table 3 Linear regression data，LOD(S/N≥3)and LOQ(S/N≥10)of the investigated compounds

2.1.4 精密度

取對照品貯備液125 μL，定容于1 mL容量瓶。重復進樣6次，記錄峰面積，得到1～4的相對標準偏差分別為1.10%、2.12%、2.98%和2.32%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復性

取供試品同一批的供試品溶液6份，在最優條件下進樣分析，記錄峰面積，得到1～4的相對標準偏差分別為1.10%、2.12%、2.98%、2.20%，表明其重復性良好。

2.1.6 穩定性

取供試品，分別于 0、4、8、12、16 和 19 h 進樣測定，考察其穩定性，得到1～4的相對標準偏差分別為2.95% 、2.02% 、4.85% 、2.32% 。

2.1.7 回收率

向已知多酚含量的馬黛茶中定量添加對照品的混合溶液，按照1.2.1方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積。4種馬黛茶多酚的回收率如表4所示。

2.2 樣品測定

各馬黛茶葉樣品按1.2.1方法平行制備3份樣品溶液，在1.2.2色譜條件進樣分析，計算結果如表5所示。結果表明，3種馬黛茶產品中的多酚含量存在顯著差異:就不同產品品種而言，馬黛茶3的多酚含量最高，馬黛茶2的最低;就不同多酚物質而言，綠原酸含量最低，其他組分的比例(除異綠原酸A)大致相當。這些差異可能與馬黛茶在采收時間、加工過程的等方面存在一定的差別所致。

表4 馬黛茶中4種多酚物質的回收率(n=3)Table 4 Recoveries for the assay of 4 components in Mate tea

表5 不同馬黛茶產品馬黛茶多酚含量差異mg/gTable 5 Difference of phenolic compounds in diffevent Mate tea mg/g

3 結論

本實驗首次建立加壓毛細管電色譜技術(pCEC)同時測定馬黛茶中的新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C的方法。通過優化pCEC的色譜條件，獲得最佳的分析條件，并通過方法學驗證證明其適合于馬黛茶多酚的定量測定。與常規的HPLC法相比，實驗中所用有機試劑、樣品用量均遠低于普通HPLC檢測用量，對于馬黛茶多酚的質量控制及其大批量檢測具有較大的可行性，可以發展成為替代常規HPLC的分析方法，從而為馬黛茶在中國市場的流通提供強有力的質量評價保證，發揮馬黛茶的保健功效。

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