Ihh/Gli1信號通路對大鼠急性脊髓損傷后脊髓內(nèi)源性干細胞增殖分化的影響

祁 文.鷹.猛.斌.杰王進升.敏吳華裕

（1.廣西中醫(yī)藥大學研究生學院，廣西 南寧 530220；2.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧530011；3.廣西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣西 南寧530001；4.廣西中醫(yī)藥大學一附院，廣西 南寧530001；5.廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，廣西 南寧530000）

Ihh/Gli1信號通路對大鼠急性脊髓損傷后脊髓內(nèi)源性干細胞增殖分化的影響

祁 文1.鷹1.猛1.斌1.杰2王進升3.敏4吳華裕5

（1.廣西中醫(yī)藥大學研究生學院，廣西 南寧 530220；2.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧530011；3.廣西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣西 南寧530001；4.廣西中醫(yī)藥大學一附院，廣西 南寧530001；5.廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，廣西 南寧530000）

目的：觀察Ihh/Gli1mRNA在脊髓中的分布及大鼠急性脊髓損傷后Ihh/Gli1mRNA信號通路對脊髓內(nèi)源性干細胞增殖分化的影響。方法：將SD大鼠隨機分為空白組（A組）、假手術組（B組）、模型組（C組）。大鼠急性脊髓損傷模型用改良Allen's法建立。將大鼠于造模后不同時間點分別處死，取以損傷脊髓為中心長1cm的脊髓進行real-time PCR、原位雜交檢測及免疫組化檢測。結(jié)果：在成年大鼠脊髓中，IhhmRNA在室管膜細胞僅有少量表達，其主要分布在白質(zhì)區(qū)。Gli1mRNA主要表達在灰質(zhì)區(qū)運動神經(jīng)元核仁以外的細胞核內(nèi)和膠質(zhì)細胞額胞質(zhì)。脊髓損傷后，IhhmRNA和Gli1mRNA表達減少，第3至7天達到最低值后又緩慢增多；Nestin+細胞和Brdu+細胞在第3至7天達到最高值后緩慢下降。結(jié)論：脊髓損傷后Ihh/Gli1信號通路對內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖起負性調(diào)控作用。

Ihh/Gli1；Nestin；Brdu；脊髓損傷；大鼠

Ihh（India Hedgehog）是Hh（Hedgehog）基因三個同源基因之一，在胚胎發(fā)育和組織器官形成等過程中具有重要作用。近年來，對Ihh的研究主要集中在腫瘤的發(fā)生機制方面。2007年，有研究者[1]在雞胚脊髓灰質(zhì)發(fā)現(xiàn)有Ihh的表達。但還未見Ihh在正常成年脊髓表達的報道，其在正常成年脊髓中的如何分布，在脊髓損傷修復過程中的表達變化，是否參與了神經(jīng)再生過程等都還不清楚。本研究通過建立大鼠脊髓損傷模型，對脊髓損傷修復過程中Ihh基因表達進行動態(tài)觀察，旨在觀察Ihh是否在正常成體脊髓中表達，弄清Ihh/Gli1信號通路在脊髓中的分布特征及二者的相關性，及其在內(nèi)原性脊髓干細胞增殖與分化過程中的作用，為更進一步研究lhhl基因信號通在神經(jīng)再生中的調(diào)控機制打下堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料和試劑

SD(Sprague-Dawley)大鼠，長沙市天勤生物技術有限公司提供；IHH原位雜交檢測試劑盒(MK2416 )、GLI1-r原位雜交試劑盒（MK2532），武漢博士德生物技術有限公司提供；5-Bromo-2'-deoxyuridine，美國Sigma公司生產(chǎn)；反轉(zhuǎn)錄反應試劑盒，美國Fermentas 公司生產(chǎn)；總RNA小量制備試劑盒，AxyPrep生產(chǎn)；BrdU鼠單克隆抗體（克隆號:ZBU30）、nestin鼠單克隆抗體（克隆號:10C2）、GFAP兔單克隆抗體（克隆號:EP13），北京中衫金橋生物技術有限公司生產(chǎn)。

1.2 實驗動物分組

本實驗選用健康的SD大鼠，成年雌性，SPF級，合格證號:SCXK(湘) 2009-0012，180只，體重200～250g。隨機分為:正常對照組(A組)6、假手術組(B組)、模型組(C組)各60只。分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20℃～25℃。

1.3 建立大鼠急性脊髓損傷模型

本實驗動物模型參照改良Allen法進行建模[2]。將大鼠適應性飼養(yǎng)1周后進行造模。術前禁食8小時，戊巴比妥鈉（10 mg/ml）按40 mg/kg的劑量行腹腔注射麻醉。咬除T9、T10椎板，使硬脊膜暴露大約5 mm，用棘突固定器鉗夾將T8、T11棘突固定，在硬膜表面放置一曲面塑料墊片，曲度與硬膜表面一致，以脊髓后正中為中心，在套管的引導下，將重10g、直徑3mm的鋼棒從5 cm高處自由落下，撞擊脊髓，致使脊髓損傷，致傷力為 50gcm，然后迅速移除鋼棒。撞擊成功后用含有慶大霉素的生理鹽水沖洗切口，醫(yī)用無菌縫合線逐層縫合切口。手術過程嚴格無菌操作。

1.4 實驗方法

1.4.1 取材

于造模成功后8h,1,3,7,14,28天六個時間點，各組隨機抽取5只大鼠進行取材。按40mg/kg行腹腔注射戊巴比妥鈉按（10 mg/ml）進行麻醉后，0.9%生理鹽水約30ml左心室灌注，用4%多聚甲醛約30ml灌注至大鼠肢體強直，取出以脊髓受打擊處為中心長約1cm長的脊髓，浸入4%多聚甲醛固定過夜，次日用常規(guī)方法脫水、透明、浸蠟包埋成石蠟塊，切片機制成4μm的石蠟切片，用于原位雜交和免疫組化檢測。另取5只腹腔注射戊巴比妥鈉按（10mg/ml）40mg/kg，取出受損脊髓（方法同前），在RNA保護液中保存，存放于-20°冰箱，行Real-time PCR檢測。

1.4.2 原位雜交(DAB)法檢測Ihh/Gli1 mRNA在脊髓中的表達

檢測操作按照Ihh、Gli1原位雜交試劑盒提供的方法進行檢測。

Ihh探針序列:

1.4.3 Real-time PCR 法檢測 Ihh和Gli1 mRNA 在脊髓中的表達

檢測方法：（1）液氮冷凍后研磨、破碎組織；（2）提取總RNA；（3）采用反轉(zhuǎn)錄反應試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。（4）熒光定量PCR；（5）樣本相對表達量測定；（6）標準曲線制作。

Beta-actin、Ihh基因和Gli1引物序列：

?? ??Gene ?Primers sequences (5'-3') ?? ??Beta-actin ?Forward primer: CCCATCTATGAGGGTTACGC ?? ?? ?Reverse priiBer: TTTAATGTCACGCACGATTTC ?? ??Ihh ?Forward primer: ATTACGAGTCCAAGGCCCAC ?? ??Gli1 ?Reverse primer: CACACGCTCCCCAGTTTCTA ?Forward primer:TTGCAGCCAGGAGTTCGATT ?Reverse primer:GGACTTCCGACAGCCTTCAA

1.4.4 免疫組織化學法檢測Brdu+、nestin+細胞的表達

將石蠟切片脫蠟和水化后，PBS液沖洗數(shù)次，沖洗期間，分別用檸檬酸液高壓修復和3%H2O2孵育，加50ul的BrdU、nestin、GFAP抗體，再經(jīng)過孵育、顯色、復染、脫水等，用中性樹膠封片。組織切片用OLYMPUS研究級顯微鏡對進行觀察，用尼康D700型單反照相機拍照，細胞內(nèi)棕黃色顆粒者定性為陽性。拍照后采用Image-pro plus 6.0軟件對照片進行分析，計算平均光密度（MOD），進行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 Ihh/Gli1mRNA原位雜交檢測結(jié)果

通過原位雜交(DAB顯色)法檢測IhhmRNA在脊髓中的分布及表達規(guī)律。結(jié)果表明在正常大鼠脊髓中存在IhhmRNA的表達，其主要分布在白質(zhì)區(qū)，室管膜細胞中也有少量表達；白質(zhì)區(qū)主要表達在膠質(zhì)細胞的胞質(zhì)里，這種膠質(zhì)細胞很有可能是星形膠質(zhì)細胞；當脊髓損傷后表達明顯減少，并在第 7天達到最低值后逐漸增多；脊髓損傷后8小時至28天的各時間點，C組與A組, B組比較均有顯著性差異(P＜0.01) （見表1）。Gli1mRNA主要表達在灰質(zhì)區(qū)運動神經(jīng)元細胞核，但核仁未見染色；膠質(zhì)細胞的胞質(zhì)也有表達，但中央管周圍未見分布；當脊髓損傷后表達明顯減少，并在第 7天達到最低值后又逐漸增多；脊髓損傷后各檢測時間點，A組同C組比較有顯著性差異（P＜0.01或P＞0.05）（見表2）。

表1 各組大鼠不同時間點IhhmRNA表達平均光密度變化情況（±s，n=5，MOD）

表1 各組大鼠不同時間點IhhmRNA表達平均光密度變化情況（±s，n=5，MOD）

注：與A組比較， *P＜0.01; 與B組比較, #P＜0.01.

G.o.p 　8.　1.　3.　7.　1.d 　2.d.　1.3.7.±...2.1...4.2.0.1.3.3.±...4.1...7.2.5.1.4.7.±...9.1...1.2.8.B 　1.4.3.±...8.1...1.3.9.1.2.5.±...2.1...5.4.0.1.3.4.±...5.1...8.3.1.C 　1.4.8.±...7.#.0...8.1.7.*.9...6.2.1.*.9...0.3.6.*.9...2.1.4.*.9...4.2.2.* #

表2 各組大鼠不同時間點Gli1mRNA表達平均光密度變化情況（±s，n=5，MOD）

表2 各組大鼠不同時間點Gli1mRNA表達平均光密度變化情況（±s，n=5，MOD）

注：與A組比較， *P＜0.05，**P＜0.01; 與B組比較, #P＜0.05，##P＜0.01.

Group 　8h 　1d 　3d 　7d 　14d 　28d.　115.17±5.31 116.68±4.17 114.54±5.90116.29±3.33 115.82±3.97116.66±4.72.　112.13±9.87 113.91±8.52 110.77±13.21108.83±10.22 113.45±9.44112.51±11.39.　103.77±3.90 100.09±5.12.90.97±6.66.93.45±3.48.95.27±2.74 **# 103.49±6.05 *

2.2 IhhmRNA、Gli1mRNA的Real-time PCR檢測結(jié)果

脊髓損傷后，脊髓中IhhmRNA表達明顯減少，并在第7天達到最小值后有逐漸增多趨勢。C組與A、B組之間在脊髓損傷后各時間點 IhhmRNA表達有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05)（見表3）。脊髓損傷后，Gli1mRNA表達亦明顯減少，至損傷第3～7天達到最小值后逐漸增多。A組同C組比較有顯著性差異（P＜0.01或P＜0.05）。（見表4）。

表3 大鼠損傷段脊髓不同時間點Ihh mRNA的Real-time PCR結(jié)果（±s，n=5）

表3 大鼠損傷段脊髓不同時間點Ihh mRNA的Real-time PCR結(jié)果（±s，n=5）

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與B組比較, #P＜0.05，##P＜0.01.

Group 　8h 　1d 　3d 　7d 　14d 　28d.　0.93±0.21 0.89±0.19 　0.95±0.30 　0.97±0.22 　0.89±0.18　0.86±0.33.　0.97±0.34 0.91±0.23 　0.89±0.29 　0.91±0.33 　0.97±0.11　0.89±0.34.　0.45±0.08 *# 0.38±0.11 **# 0.11±0.06 **## 0.08±0.05 **## 0.12±0.04 **## 0.16±0.06 **##

表4 大鼠損傷段脊髓不同時間點Gli1 mRNA實時熒光相對定量PCR結(jié)果（±s，n=5）

表4 大鼠損傷段脊髓不同時間點Gli1 mRNA實時熒光相對定量PCR結(jié)果（±s，n=5）

Note：與A組比較，**P＜0.01; 與B組比較, #P＜0.05. ## P＜0.01.

Group 　8h 　1d 　3d 　7d 　14d 　28d.　0.98±0.33 　1.01±0.12 　0.99±0.16　1.00±0.17 　0.94±0.24　0.89±0.36.　0.95±0.08 　0.96±0.41 　0.85±0.33　0.89±0.26 　0.90±0.31　0.99±0.23.　0.45±0.16 **## 0.35±0.16 **## 0.10±0.04 **## 0.17±0.05 **## 0.28±0.18 **# 0.29±0.19 **##

2.3 免疫組織化學法檢測BrdU+和Nestin+細胞結(jié)果

Brdu+細胞主要表達在正常脊髓的白質(zhì)區(qū)，脊髓其他區(qū)域未見表達。脊髓損傷后Brdu+細胞表達明顯增多，第3天達到最高值后又逐漸下降（見表 5）。Nestin+細胞主要表達在正常脊髓前角運動神經(jīng)元的軸突，室管膜附近僅有極少量表達，胞質(zhì)著色較淡。脊髓損傷后Nestin+細胞在前角運動神經(jīng)元軸突和室管膜附近表達均增多； A組與C組比較P＜0.01，并且在第7天達到峰值（見表6）。

表5 各組大鼠不同時間點Brdu+細胞在脊髓表達變化情況（±s ，n=5，MOD）

表5 各組大鼠不同時間點Brdu+細胞在脊髓表達變化情況（±s ，n=5，MOD）

Note：與A組比較，**P＜0.01; 與B組比較B, #P＜0.05，##P＜0.01.

Group　8h 　1d 　3d 　7d 　14d 　28d.　68.34±4.21　67.51±4.22　66.12±5.10 69.05±4.93 67.25±3.41　67.72±4.67.　67.34±2.37　68.35±2.61　67.47±3.54 68.61±3.33 67.69±3.88　67.22±2.59.　74.83±2.05 **# 79.16±1.49 **## 80.99±1.87 **## 　79.62±1.26 73.91±3.78　68.96±1.28

表6 各組大鼠不同時間點Nestin+細胞在脊髓表達變化情況

2.4 Brdu+、Nestin+、IhhmRNA、Gli1mRNA表達的相關性分析

對各組檢測數(shù)據(jù)進行偏相關分析。結(jié)果顯示：IhhmRNA與Nestin+細胞的表達相關系數(shù)為-0.542，P=0.034＜0.05，二者呈負相關（見圖1）；IhhmRNA與Brdu+細胞的表達相關系數(shù)為-0.020，P=0.837＞0.05，二者沒有相關性；IhhmRNA與Gli1mRNA相關系數(shù)為0.739，P=0.002＜0.01，二者呈正相關（見圖2）。

圖1 IhhmRNA 和Nestin+細胞表達水平相關性分析散點圖

圖2 IhhmRNA 和Gli1mRNA表達水平相關性分析散點圖

3 討論

脊髓損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴重創(chuàng)傷。有研究認為脊髓中存在內(nèi)源性神經(jīng)干細胞（endogenous neural stem cells,ENSCs），脊髓損傷后能大量增殖，具有自我修復潛能[4-6]。以往研究認為神經(jīng)不能再生，ENSCs的發(fā)現(xiàn)給脊髓損傷帶來了治愈希望。巢蛋白（Nestin）是神經(jīng)干細胞的特征性標志物，已被廣泛用于神經(jīng)干細胞的鑒定。BrdU陽性代表增殖細胞，Nestin陽性代表已分化的神經(jīng)干細胞，所以Nestin陽性細胞和BrdU陽性細胞的多少，可以反映損傷后脊髓的自我修復能力的大小。本實驗研究表明，脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細胞在脊髓損傷后的增殖分化明顯增強。

多種不同因素影響神經(jīng)干細胞的的增殖分化過程，這其中尤以信號基因調(diào)控較為關鍵。目前，研究較多的有Wnt 信號通路、MNotch 信號通路、信號蛋白 Shh、螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族等信號轉(zhuǎn)導通路，它們當中有發(fā)揮上調(diào)神經(jīng)干細胞增殖分化作用的，也有發(fā)揮下調(diào)作用的。這些信號通路在神經(jīng)再生過程中扮演者重要角色。

Hedgehog在胚胎發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)、骨與軟骨等組織形成等過程中具有重要作用。Shh是 Ihh 的同源基因，現(xiàn)已被證實參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化過程[7]，且能促進內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖[8]，對外源性神經(jīng)干細胞的增殖分化也有促進作用[9]。Ihh.Shh 的結(jié)構(gòu)雖然在碳端區(qū)別明顯，但在氮端結(jié)構(gòu)高度相似，二者極可能有相似的功能[10]。

本研究通過原位雜交和 Real-time PCR方法檢測IhhmRNA，證實了其在成年大鼠脊髓中的表達，也明確了其在成年大鼠脊髓中的表達分布情況。本研究結(jié)果表明，正常成年大鼠的脊髓中存在Ihh的表達，絕大部分Ihh表達在脊髓的白質(zhì)區(qū)，僅少量表達在中央管附近；表達在白質(zhì)區(qū)的可能主要分布在星形膠質(zhì)細胞。本研究觀察到在脊髓損傷修復的過程中神經(jīng)細胞再生活躍，Nestin+、Brdu+細胞在脊髓損傷后的1～7天內(nèi)表達明顯增多，到第3-7天達到峰值而后逐漸降低。而Ihh/Gli1mRNA的表達在脊髓損傷后逐漸降低（與正常組比較P＜0.01），并在第7天達到最小值后又呈現(xiàn)出逐漸增多的趨勢。Nestin+、Brdu+細胞和IhhmRNA、Gli1mRNA在脊髓損傷修復過程中的表達趨勢相反。通過對 Ihh/Gli1信號通路與內(nèi)源性神經(jīng)元增殖分化進行相關性分析，發(fā)現(xiàn) Ihh、Gli1mRNA表達與內(nèi)源性神干細胞增殖之間呈負相關。

最近有研究者觀察到在斑馬魚胚胎的少突膠質(zhì)細胞祖細胞的在分化的同時脊髓前側(cè)的底板細胞發(fā)現(xiàn)有Ihh-b表達，通過研究認為其調(diào)控多形核白細胞前體細胞向運動神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化是通過抑制神經(jīng)前體細胞的增殖來完成的[11]。這與本研究觀察到的結(jié)果是一致的。這說明 Ihh在促進神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中也扮演重要角色，脊髓損傷后Ihh/Gli1信號轉(zhuǎn)導通路對內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖可能起負性調(diào)控作用，但其確切機制還不清楚，Ihh/Gli1信號通路在脊髓修復過程中的作用靶點和調(diào)控機制還有需要更深入研究。

[1] Aglyamova GV, Aganwala S. Gene expression analysis of the hedgehog signaling cascade in the chick midbrain and spinal cord[J].Dev Dyn, 2007,236(5):1363-1373.

[2] 熊春翔,宗少暉,曾高峰,等.大鼠Allen's脊髓損傷模型的建立及評價[J].廣西醫(yī)科大學學報,2011,28(2): 215-217.

[3] Nusslein-Volhard C,Wieschaus E.Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila [J].Nature,1980,287 (5785):795-801.

[4] HorkyL L,Galimi F,Gage FH,et al. Fate ofendogenous stem/progenitor cells following spinal cord injury[J].J Comp Neurol,2006,498(4):525-538.

[5] Ohori Y, Yamamoto S, Nagao M, et al. Growth factor treatment and genetic manipulation stimulate neurogenesis and oligoden-drogenesis by endogenous neural progenitors in the injured adult spinal cord[J].Neurosci,2006,26(46): 11948-11960.

[6] Meletis K,Barnabe-Heider F,Carlen M,et al. Spinal cord in-jury reveals multilineage differentiation of ependymal cells[J].PLoS Biol,2008,6(70):e182.

[7] Christian JL. BMP,Wntand Hedgehog signals: How far can they go[J].Curr Opin Cell Bio,2000,12(2):244-249.

[8] 趙斌.內(nèi)源性Shh對成年大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生的作用[D].蘭州:蘭州大學,2008.

[9] 胡慧敏,羅卓荊,胡學昱,等.音猬因子體外誘導人骨髓基質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細胞的研究[J].中國脊柱脊髓雜志,2006,16(5):380-383.

[10] Mcmahon AP.More surprises in the Hedgehog signaling pathway[J].Cell,2000,100(2):185-188.

[11] Chung AY,Kim S,Kim E,et al. Indian hedgehog.function is required for the specification of oligodendrocyte progenitor cells in the zebrafish CNS[J].J Neurosci,2013,33(4):1728-1733.

Effection of Ihh/Gli1 signal pathways on the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells after acute spinal cord injuries

Objective: To observe the distribution and expression of Ihh/ Gli1mRNA in spinal cord of rat after injury and analyze the regulation of Ihh/Gli1 signal transduction pathways on endogenous neural stem cells. Methods: The Sprague Dawley rats were randomly divided into gap group, pseudo surgery group, model group. The rat models of acute spinal cord injury were established by modified Allen’s method in the experiment..rats were sacrificed in each group at different time point, and all of the center of upper and lower sections of the 5mm from the injured spinal cords the rats was examined by the in situ hybridization,real-time PCR and immunohistochemistry. Results: Ihh mRNA was mainly distributed in the white matterin of the spinal cord of normal adult rats, and as well as minor distributed in ependymocytes. Gli1mRNA are mainly distributed in the cell nucleolus of gray matter neurons in addition to outside the plasmosome and the cytoplasm of glial cells. After spinal cord injury, the expression of Ihh/ Gli1mRNA was reduced, and there were the lowest expression of Ihh/Gli1mRNA during.to.days, and then the expression of Ihh mRNA gradually increased. The expression of Nestin+ cell and Brdu+ cell were increased after spinal cord injury, and there were the most expression during.to.days, and then reduced gradually. Conclusions: Ihh/gli1 transduction pathway regulates the proliferation of endogenous neural stem cells negatively.

Ihh/Gli1; Nestin; Brdu; spinal cord injury; rat

R459.9..

A....

1008-1151(2015)08-0081-04

2015-07-10

廣西自然科學基金課題（2012GXNSFAA053123）。

祁文（1975－），男，廣西中醫(yī)藥大學研究生學院碩士研究生導師，博士，副主任醫(yī)師，研究方向為脊柱脊髓疾病的基礎與臨床。