新藤黃酸聯合阿霉素誘導人乳腺癌MCF－7細胞凋亡的研究

謝晨燁，張 鳳，程 卉，蘇婧婧，李慶林

（安徽中醫藥大學科研實驗中心 省部共建教育部新安醫學重點實驗室，安徽 合肥 230038）

乳腺癌是全球發病率居首位的女性惡性腫瘤。統計結果顯示，乳腺癌同樣是我國女性最常見的惡性腫瘤，且發病率呈逐年上升趨勢［1］。目前，對于乳腺癌的治療仍以化學治療為主，作為臨床一線治療乳腺癌的藥物，蒽環類抗腫瘤抗生素阿霉素（adriamycin，ADM）及其衍生物的應用越來越普遍。然而化學治療藥物易出現耐藥性，進而導致用藥劑量加大，毒性和不良反應增加等不利因素。目前臨床治療已逐漸采用聯合用藥方案，以期提高療效的同時不增加藥物毒性，同時減少耐藥性［2］。故本實驗選用新藤黃酸（gambogennic acid，GNA）與 ADM作為目標藥物進行研究，探討其聯合應用對人乳腺癌細胞MCF－7凋亡的影響。

1 材料

1．1 細胞株 人乳腺癌細胞 MCF－7，購于中國科學院上海細胞庫。

1．2 藥物 GNA為亮黃色結晶粉末，純度＞99．0%，批號2012120101，由安徽中醫藥大學科研實驗中心GNA課題組提供；ADM：浙江海正藥業股份有限公司，批號120901。

1．3 主要試劑 達爾伯克培養基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）干粉：Gibco公司，批號 1218594；特級胎牛血清（fatal bovine serum，FBS）：天津市灝洋生物制品科技責任有限公司，批號20150530；Trypsin胰蛋白酶：Sigma公司，批號20120711125；甲 基 噻 唑 基 四 唑 （methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）：Sigam公司，批號 M2128；二甲基亞 砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO）：Amresco 公司，批號 20120210；4′，6－二脒基－2－苯基吲哚（4′，6－diamidino－2－phenylindole，DAPI）染色液：碧云天生物技術研究所，批號c1002；膜聯蛋白Ⅴ（annexinⅤ，AV）－異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）／碘化丙啶（propidium iodide，PI））細胞凋亡檢測試劑盒：上海貝博生物公司，批號BB140041；其他試劑均為分析純。

1．4 主要儀器 MCO－175CO2培養箱：日本Sanyo公司；LD4－8型低速離心機：北京醫用離心機廠；96孔和6孔平底培養板：美國Corning costar公司；SPECTRA max M2e酶標儀：美國 Molecular Devices公司；JW2502電子分析天平：上海精密科學儀器有限公司；Olympus CKX41倒置顯微鏡以及Olympus BX51熒光顯微鏡：日本 Olypus公司；FACS Calibur流式細胞儀：美國Becton Dickinson公司。

2 方法

2．1 細胞培養 將人乳腺癌細胞MCF－7接種于培養瓶中，培養基為DMEM（含10%FBS、青霉素100 U／ml和鏈霉素100U／ml），置于37℃、5%CO2培養箱，相對飽和濕度的條件下培養。細胞呈單純貼壁生長，隔2～3d換液，待細胞長至70%～80%的密度，用不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化傳代，每2～3d傳代一次。

2．2 MTT比色法測定細胞活力 消化收集對數生長期的MCF－7細胞并調整成濃度為4×104／mL的單細胞懸液，接種于96孔板，每孔接種100μL，接種24h后處理。倒置顯微鏡下觀察確認細胞貼壁狀態良好。加藥組每孔分別加入100μL培養液配制的藥物，使GNA終濃度分別為0．125、0．25、0．5、1、2、4μmol／L，ADM 終濃度則為0．5、1、2、4、8、16μmol／L。每一濃度設6個復孔，并設空白對照組，加入100μL培養液。培養24h后，棄上清，每孔加5mg／mL的 MTT 20μL，37℃，5%CO2培養箱孵育4h，吸去上層液體，以150μL DMSO溶解藍紫色顆粒同時置于搖床上振搖至溶解完全，在全自動酶標儀上室溫避光振蕩混勻并于490nm波長測定各孔的光密度（optical density，OD）值，計算單獨用藥時細胞的存活率。并以此為基礎，結合中效原理［3］檢測兩種藥物不同劑量聯合配伍后的MTT細胞活力。細胞存活率＝實驗組OD值／對照組OD值×100%。

2．3 倒置顯微鏡下觀察細胞形態 對數生長期的MCF－7細胞消化收集并調整成濃度為2×105／mL的細胞懸液，接種于6孔板中，每孔2mL。細胞置于37℃恒溫、5%CO2培養箱中培養24h，當細胞長至70%時換用含有1μmol／L GNA、4μmol／L ADM、1μmol／L GNA＋4μmol／L ADM 的新鮮培養液，同時設空白對照組，細胞繼續培養24h后于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2．4 DAPI細胞核染色 將處于對數生長期的MCF－7細胞接種到6孔板中，每孔分別加入2mL細胞培養基。種板后24h，吸棄各孔中的舊培養液，加藥組各孔中分別加入含 GNA 1μmol／L、ADM 4μmol／L、GNA 1μmol／L＋ADM 4μmol／L的培養基2mL，未給藥組各孔中加入完全培養基2 mL。置37℃恒溫培養箱中孵育24h后，棄各孔中原有培養液，以每孔1mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）輕洗細胞1次；再加入1mL 2%多聚甲醛固定15min，棄多聚甲醛，PBS 1mL漂洗細胞；再加入DAPI在室溫下避光作用10min，最后PBS輕洗細胞1次，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2．5 流式細胞儀檢測AV／PI雙染 MCF－7細胞常規傳代于培養瓶中，待細胞密度約為70%～80%時，加藥組各瓶中分別加入含 GNA 1μmol／L、ADM 4μmol／L、GNA 1μmol／L＋ADM 4μmol／L的培養基4mL，未給藥組中加入完全培養基4mL。24h后常規收集各組實驗細胞，用PBS輕洗2次后，胰酶消化并吹散細胞轉移置離心管中，2 000 r／min，離心5min，棄上清液。每管加1mL PBS輕洗2次，再次離心。400μL AV結合液重懸，分別加入5μL AV－FITC和10μL PI溶液，混勻細胞，避光孵育15min后，過篩至流式專用管內，1h內流式細胞儀檢測。

2．6 統計學方法 所有數據均采用SPSS 17．0統計學軟件進行統計學處理，連續型變量用“均數±標準差（±s）”進行統計學描述。多組均數比較采用單因素方差分析，均數之間多重比較采用LSD法。P＜0．05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3．1 GNA與ADM單獨及聯合應用對細胞活力的抑制作用 GNA和ADM單獨作用于MCF－7細胞24h后，結果表明，與空白對照組比較，GNA和ADM均能明顯抑制細胞增殖（P＜0．01）。而GNA和ADM作用 MCF－7細胞24h后的半數抑制率（inhibition concentration 50，IC50）分別為 3．115、9．304μmol／L。根據中效原理計算驗證后選擇1μmol／L GNA＋4μmol／L ADM 作為聯合用藥濃度。結果見圖1、圖2。

3．2 GNA與ADM單獨及聯合應用對細胞形態的影響 倒置顯微鏡下觀察可見，空白對照組細胞貼壁牢固，細胞邊緣清晰，體積較大，幾乎無懸浮細胞。與空白對照組比較，1μmol／L GNA作用于 MCF－7細胞24h后，部分細胞邊緣發亮，細胞固縮變圓，體積變小，少數細胞貼壁不牢，呈半貼壁狀態。而4 μmol／L ADM 作用于 MCF－7細胞24h后，可觀察到多數細胞固縮變圓，漂浮于培養液中。1μmol／L GNA和4μmol／L ADM 聯合用藥組作用 MCF－7細胞24h后，與單獨用藥組比較，其大多數細胞均漂浮于培養液中，部分細胞出現空泡或細胞破裂呈壞死狀。見圖3。

3．3 GNA與ADM單獨及聯合應用誘導的細胞凋亡 細胞發生凋亡時，染色質發生固縮［4］，DAPI可快速穿透細胞膜與細胞核內DNA鏈結合，同時對活細胞和凋亡細胞進行核染。本組實驗中，熒光顯微鏡下可見空白對照組正常細胞核呈現均一暗淡的藍色，而GNA與ADM單獨用藥24h后，部分細胞核呈藍白色，碎塊狀致密濃染，少數細胞核可見細胞核內碎裂，具有明顯凋亡特征。而聯合用藥組凋亡細胞數量較單獨給藥組明顯增加，亮度趨向亮藍白色。結果見圖4。

3．4 GNA與ADM單獨及聯合應用對細胞凋亡率的影響 GNA與ADM單獨和聯合用藥分別作用于MCF－7細胞24h后，流式細胞儀檢測結果顯示，與未給藥組比較，單獨用藥組細胞凋亡率均顯著上升（P＜0．01），而1μmol／L GNA＋4μmol／L ADM聯合用藥組細胞凋亡率較單獨用藥組顯著升高（P＜0．01）。結果表明，GNA與ADM 聯合用藥誘導MCF－7細胞凋亡的作用顯著優于單獨用藥，兩藥聯用具有協同效應。見表1、圖5。

表1 GNA與ADM單獨和聯合應用對MCF－7細胞凋亡率的影響（±s，n＝3）

表1 GNA與ADM單獨和聯合應用對MCF－7細胞凋亡率的影響（±s，n＝3）

注：含有相同右上標符號的組別相比較，P＞0．05；不含相同右上標符號的組別相比較，P＜0．05。

空白對照 2．37±0．32＊1μmol／L GNA 40．36±3．17＃4μmol／L ADM 42．06±3．03＃1μmol／L GNA＋4μmol／L ADM 聯合用藥 69．89±5．11△

4 討論

乳腺癌發病率高，且頗具侵襲性，是女性最常見的惡性腫瘤之一［5］。近年來，隨著手術、放射治療、化學治療、內分泌治療和分子靶向治療及中醫中藥等各種治療方法的改進，乳腺癌患者的存活率有了一定程度的提高，因此，多學科綜合治療備受關注。臨床已出現多種聯合用藥方案，其中以蒽環類與其他藥物聯用為主［6］。

聯合用藥是指為了達到治療目的而采用的兩種或兩種以上藥物同時或先后應用，以期提高療效而不增加毒性，并減少耐藥性的出現。聯合用藥時應選擇作用機制不同的藥物聯用，從而發揮其協同作用［7］?；瘜W治療藥物單獨使用時毒性和不良反應嚴重，劑量稍大則容易對機體正常細胞功能產生影響，長期使用后惡性腫瘤容易對藥物產生耐藥性，導致療效降低。這些均是妨礙各種惡性腫瘤治療的難題，也是使得乳腺癌化學治療失敗的重要原因。聯合用藥方案則可結合傳統中藥和臨床常用西藥不同的作用機制，從而達到全面抑制惡性腫瘤發展，增加療效并降低不良反應的目的。

GNA是一種傳統中藥，具有作用強、毒性低、穩定性好和抗癌譜廣等特點。研究［8］發現GNA體外能夠抑制多種類型的癌癥細胞增殖，其抗腫瘤作用機制與誘導腫瘤細胞凋亡，抑制細胞增殖，阻滯細胞周期進程有關［9－12］。ADM 是一種蒽環類化學治療藥物，對機體可產生廣泛的生物化學效應，具有強烈的細胞毒性作用。其作用機制主要是嵌入DNA后抑制核酸的合成，可抑制RNA和DNA的合成。ADM抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬細胞周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用［13］。

本實驗結果表明，GNA和ADM單用或聯合用藥都能誘導人乳腺癌 MCF－7細胞的凋亡。MTT結果顯示，兩藥單獨或聯合應用均可對乳腺癌MCF－7細胞造成生長抑制，并呈一定的劑量依賴性。而從DAPI細胞核染色實驗觀察得知，與單獨用藥組比較，GNA及ADM聯合應用時能夠顯著誘導MCF－7細胞的凋亡，細胞核碎裂，具有明顯凋亡特征。流式細胞儀檢測結果則進一步證明了GNA與ADM聯合應用誘導 MCF－7細胞的凋亡現象。從本實驗可以看出：兩藥合用時，不僅對MCF－7細胞的凋亡效應增加，而且各自的需用量均比單用要小。這也充分說明這兩種藥物聯合用藥具有協同增效的作用，符合聯合用藥增效減毒的原則。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A．Cancer statistics，2013［J］．CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11－30．

［2］McCarthy M，Auda G，Agrawal S，et al．Invivoanticancer synergy mechanism of doxorubicin and verapamil combination treatment is impaired in BALB／c mice with metastatic breast cancer．［J］．Exp Mol Pathol，2014，97（1）：6－15．

［3］Chou TC，Talalay P．Quantitative analysis of doseeffect relationships：the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors ［J］．Adv Enzyme Regul，1984，22：27－55．

［4］蔣根靈，李慶林．天麻素通過下調ERK1／2－p38信號通路保護谷氨酸損傷的PC12細胞［J］．安徽中醫學院學報，2013，32（3）：71－75．

［5］郭文竹，魯衍強，李瑛．乳腺癌干細胞的研究進展［J］．中國腫瘤臨床與康復，2014，21（3）：382－384．

［6］Croom KF，Dhillon S．Bevacizumab：a review of its use in combination with paclitaxel or capecitabine as firstline therapy for HER2－negative metastatic breast cancer．［J］．Drugs，2011，71（16）：2213－2229．

［7］Hwang JT，Ha J，Park OJ，et al．Combination of 5－fluorouracil and genistein induces apoptosis synergistically in chemo－resistant cancer cells through the modulation of AMPK and COX－2signaling pathways［J］．Biochem Biophys Res Commun，2005，332（2）：433－440．

［8］程卉，彭代銀，王效山，等．新藤黃酸體內外抗腫瘤作用研究［J］．中草藥，2008，39（2）：236－240．

［9］Yan F，Wang M，Chen H，et al．Gambogenic acid mediated apoptosis through the mitochondrial oxidative stress and inactivation of Akt signaling pathway in human nasopharyngeal carcinoma CNE－1cells［J］．Eur J Pharmacol，2011，652（1－3）：23－32．

［10］Yan FG，Wang M，Li J，et al．Gambogenic acid induced mitochondrial－dependent apoptosis and referred to phosphor－Erk1／2and phosphor－p38MAPK in human hepatoma HepG2cells［J］．Environ Toxicol and Pharmac，2012，33（2）：181－190．

［11］Chen HB，Zhou LZ，Mei L，et al．Gambogenic acidinduced time－and dose－dependent growth inhibition and apoptosis involving Akt pathway inactivation in U251glioblastoma cells［J］．J Nat Med，2012，66（1）：62－69．

［12］Cheng H，Su JJ，Peng JY，et al．Gambogenic acid inhibits proliferation of A549cells through apoptosis－inducing through up－regulation of the p38MAPK cascade［J］．J Asian Nat Prod Res，2011，13（11）：993－1002．

［13］Chen J，Wang W，Wang H，et al．Combination treatment of ligustrazine piperazine derivate DLJ14and adriamycin inhibits progression of resistant breast cancer through inhibition of the EGFR／PI3K／Akt survival pathway and induction of apoptosis［J］．Drug Discov Ther，2014，8（1）：33－41．