CD44v6與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系研究

謝建偉，黃昌明，鄭朝輝，李 平，王家鑌，林建賢

目前，胃癌仍是我國常見的消化道腫瘤之一，每年約有870 000的新發(fā)病例[1]。人類CD44基因高度保守，通過選擇性剪切和蛋白修飾形成不同亞型[2]。有研究表明，CD44v6介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附，在腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用[3－4]。本研究通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)胃癌組織中CD44v6蛋白的表達(dá)，探討CD44v6與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 收集2006年12月－2008年5月行根治性手術(shù)切除的胃癌標(biāo)本208例，男性154例，女性54例，年齡中位數(shù)63.01歲（32～88歲）；高分化腺癌72例，中分化腺癌81例，低分化腺癌55例；行根治性遠(yuǎn)端胃大部切除100例，根治性近端胃大部切除33例，根治性全胃切除75例。術(shù)后按2009年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）公布的胃癌第7版TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期40例，Ⅲ期136例，Ⅳ期7例。全組共清掃淋巴結(jié)6 549枚，中位數(shù)為31枚。患者術(shù)前均未行放、化療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)染色采用SP法。廣譜二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），鼠抗人CD44v6單克隆抗體（英國Abcam公司）。染色程序按試劑盒說明書進(jìn)行，主要包括福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，滴加一抗、二抗及鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶復(fù)合物，DAB顯色，對(duì)比染色封片。CD44v6的稀釋比為1∶2 000，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。每例癌組織均有鄰近非癌組織作為對(duì)照。

1.2.2 結(jié)果判定 CD44v6以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)定和分析：不著色為0分，淺粉色或黃色為1分，粉色或棕黃色為2分，紅色或黃褐色為3分；著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率＜5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，＞50%記3分。由2位資深病理科醫(yī)師在雙盲條件下獨(dú)立進(jìn)行結(jié)果判定。在低倍鏡下（×40）每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)視野，所得結(jié)果取平均數(shù)，將染色程度與染色細(xì)胞百分率得分相乘，其乘積為最后得分。0～1分為陰性（－），2～3分為弱陽性（＋），4～6分為中等陽性（），＞6分為強(qiáng)陽性（）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中，（－）和（＋）定為陰性，（）和（）定為陽性。

1.2.3 隨訪情況 術(shù)后隨訪由專人負(fù)責(zé)，采用門診、電話、信件、上門等方式進(jìn)行，隨訪頻率為患者術(shù)后2年內(nèi)，每3月隨訪1次，2年后6～12月隨訪1次。記錄的生存時(shí)間是自手術(shù)時(shí)間至末次隨訪時(shí)間或死亡時(shí)間或隨訪數(shù)據(jù)庫截止的時(shí)間（2015年5月）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。用Spearman方法對(duì)CD44v6與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性進(jìn)行分析；用Life－Table法進(jìn)行生存分析。Kaplan－Meier法制作生存曲線，生存率的比較采用Log－rank法檢驗(yàn)。應(yīng)用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析。

2 結(jié) 果

2.1 CD44v6蛋白在胃癌中的表達(dá) CD44v6在胃癌組織中的表達(dá)陽性率為59.1%（123／208），在癌旁組織 中 不 表 達(dá) （0／208），差 別 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（χ2＝174.63，P＝0.000，圖1）。

圖1 CD44v6在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色 ×200）Fig 1 The expression of CD44v6protein in gastric cancer and non－cancerous tissues（IHC ×200）

2.2 CD44v6蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系CD44v6蛋白表達(dá)陽性與表達(dá)陰性患者的中位生存時(shí)間分別為58.3和36.2月，術(shù)后5年生存率分別為38.8%和76.3%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2A）。單因素分析提示，CD44v6高表達(dá)、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期與預(yù)后密切相關(guān)。多因素分析提示，CD44v6高表達(dá)和TNM分期為胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素（表1，2）。

2.3 胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素分析 Logistic回歸分析顯示，腫瘤浸潤深度和CD44v6表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而腫瘤大小及其他臨床病理學(xué)指標(biāo)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

2.4 胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CD44v6表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響 全組208例患者中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移157例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的中位生存時(shí)間分別為40.2和61.4月，術(shù)后5年生存率分別為44.4%和79.5%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2B）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，CD44v6表達(dá)陽性與陰性的5年生存率分別3 0.3%和67.7%（P＜0.05），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，CD44v6表達(dá)陽性與陰性的5年生存率分別77.3%和81.8%（P＞0.05，圖2C，2D）。

表1 臨床病理資料預(yù)后單因素分析Tab 1 The univariate analysis of clinical variables of patients

圖2 胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CD44v6表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響Fig 2 The influence on prognosis of patients with lymph node metastasis and CD44v6expression

3 討 論

CD44基因定位于11p12－13染色體，屬于黏附分子家族，可與透明質(zhì)酸等配體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附，發(fā)揮廣泛的生物學(xué)功能。CD44v6廣泛參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[5－7]。Ryu等認(rèn)為，CD44v6在胃癌中的表達(dá)率為53.3%，其表達(dá)水平與胃癌的浸潤深度密切相關(guān)[8]。Müller等認(rèn)為，對(duì)418例根治性切除胃癌患者預(yù)后研究發(fā)現(xiàn)，CD44v6并不是預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后因子[9]。本研究結(jié)果顯示，CD44v6在胃癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，推測(cè)CD44v6可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。CD44v6表達(dá)陽性與胃癌預(yù)后不良有關(guān)，多因素生存分析表明，CD44v6蛋白表達(dá)為胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素，這與部分國外學(xué)者研究結(jié)果一致[10－11]。 提 示 CD44v6 可 能 作為一個(gè)影響胃癌浸潤行為和預(yù)測(cè)不良預(yù)后的指標(biāo)。

表2 Cox模型預(yù)后多因素分析Tab 2 Multiple stepwise regression analysis with the Cox proportional hazards model

表3 胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)因素Logistic回歸分析Tab 3 Logistic regression analysis of related factors of lymph node metastasis in gastric cancer

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌最常見的轉(zhuǎn)移方式，淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后的重要因素之一。Xin等研究早期胃癌和進(jìn)展期胃癌中CD44v6表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，CD44v6表達(dá)陽性的胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，CD44v6表達(dá)陽性患者3年和5年生存率明顯降低[12]。Ozmen等認(rèn)為，CD44參與胃癌淋巴管生成、脈管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)中表達(dá)顯著高于陰性淋巴結(jié)[13]。本研究資料顯示，CD44v6和浸潤深度是影響胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步分層分析發(fā)現(xiàn)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，CD44v6表達(dá)陽性與陰性的5年生存率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（30.3%vs67.7%，P＜0.05），而在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，CD44v6表達(dá)陽性與陰性的5年生存率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（77.3%vs81.8%，P＞0.05）。這提示CD44v6與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過促進(jìn)胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移從而影響胃癌患者預(yù)后。

綜上所述，腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44v6與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，進(jìn)一步深入研究CD44v6功能有助于判斷胃癌預(yù)后，也可為胃癌靶向治療提供理論依據(jù)。

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