基于PDTX模型研究原發(fā)性肺癌順鉑耐藥與ERCC1 IGFBP5表達(dá)水平的關(guān)系*

展丙香 程龍強(qiáng) 羅朋 章菊 王保龍

·基礎(chǔ)研究·

基于PDTX模型研究原發(fā)性肺癌順鉑耐藥與ERCC1 IGFBP5表達(dá)水平的關(guān)系*

展丙香 程龍強(qiáng) 羅朋 章菊 王保龍

目的：構(gòu)建PDTX（patient-derived tumor xenografts）肺癌模型，探索ERCC1、IGFBP5的表達(dá)水平與原發(fā)性肺癌順鉑耐藥的關(guān)系。方法：取新鮮切除的84例肺癌組織移植于裸鼠（BALB/c）的皮下，構(gòu)建PDTX模型，分析一代成瘤率與臨床病理參數(shù)關(guān)系。三代移植瘤接受順鉑化療，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)敏感組和耐藥組ERCC1、IGFBP5的表達(dá)情況。結(jié)果：移植瘤一代成瘤率32.14%（27/84），二代成瘤率88.89%（24/27），三代成瘤率95.83%（23/24），能否一代成瘤與腫瘤的大小、分化、分級(jí)、病理類型相關(guān)；此模型移植瘤在傳代中能夠保持親代腫瘤的結(jié)構(gòu)特征。ERCC1在耐藥組表達(dá)高于敏感組，而IGFBP5在耐藥組表達(dá)低于敏感組。結(jié)論：構(gòu)建了肺癌組織塊移植瘤模型，其能夠保持親代癌種的結(jié)構(gòu)特征，是研究肺癌發(fā)生和探索腫瘤耐藥機(jī)制的理想模型。原發(fā)性肺癌順鉑耐藥性與ERCC1、IGFBP5的表達(dá)水平相關(guān)。

肺癌 異種移植模型抗腫瘤實(shí)驗(yàn) ERCC1 IGFBP5 順鉑耐藥

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，隨著吸煙、環(huán)境污染等問題的逐漸加重，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)。目前對(duì)肺癌的治療主要是手術(shù)、化療、放療，雖然分子靶向藥物化療研究取得階段性成果，但其依附于患者靶標(biāo)基因的檢測(cè)，由于患者基因表達(dá)差異性使其不能在臨床普及。因此對(duì)于不能耐受手術(shù)的晚期肺癌患者以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是其主要治療手段，但頻發(fā)的順鉑耐藥阻礙了其在臨床的應(yīng)用，使得治療效果不如人意。美國癌癥協(xié)會(huì)的資料顯示，癌癥死亡病例中，約61%化療藥物的原發(fā)性耐受，33%獲得性耐受［1］。

順鉑是一種細(xì)胞周期非特異性細(xì)胞毒藥物，能與DNA形成不同類型的加合物，破壞DNA正常的結(jié)構(gòu)，從而抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2］。研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷修復(fù)功能的異常增加可能是原發(fā)性順鉑耐藥的主要原因［3］。核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白1（excision repair cross-complementing gene1，ERCC1）是切除修復(fù)系統(tǒng)中重要的成分，在切除修復(fù)中起到重要的調(diào)節(jié)或限速的作用。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5（IGFBP5）是IGF軸的重要成員，通過與胰島素樣生長因子（IGFs）結(jié)合來影響細(xì)胞的生長、分化、衰老、病變等過程［4］。有研究證實(shí)IGF軸通路影響卵巢癌的順鉑耐藥性［5］，但I(xiàn)GFBP5是否影響肺癌的順鉑耐藥性還鮮有報(bào)道。

PDTX（patient-derived tumor xenografts）模型即取患者的肺癌組織種植到免疫缺陷鼠的體內(nèi)增殖、傳代，培養(yǎng)出來的腫瘤組織不僅保持原肺癌組織的生物學(xué)特征，還保留了原組織的結(jié)構(gòu)特征［6-7］。其為評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物的療效、篩選耐藥基因、探索耐藥機(jī)制等方面提供良好平臺(tái)［8-9］。本研究通過構(gòu)建PDTX順鉑化療模型，探索ERCCI、IGFBP5的表達(dá)與原發(fā)順鉑耐藥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 收集安徽省立醫(yī)院胸外科自2014年2月至2014年12月經(jīng)臨床診斷明確的肺癌患者84例，其中鱗狀細(xì)胞癌31例、腺癌51例、腺鱗癌1例、大細(xì)胞癌1例。所有患者均經(jīng)手術(shù)治療，并由手術(shù)后冰凍及病理切片證實(shí)為肺癌。術(shù)中冰凍切除的癌組織分裝4份，1份用于構(gòu)建動(dòng)物模型，3份迅速置于液氮中備用。癌組織對(duì)應(yīng)的癌旁均取自距癌灶5 cm以外的正常組織。所有的患者在手術(shù)之前未接受過放、化療治療。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 BALB/c裸鼠［生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002］購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，雌鼠，4～6周齡，體質(zhì)量約20 g。所有裸鼠于安徽省立醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心在無特定病原體（specified pathogen-free，SPF）條件下飼養(yǎng)。兔抗人的ERCC1多克隆抗體夠自美國Proteintech公司，兔抗人的IGFBP5抗體購自中國武漢博士德公司。SP檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限過公司。注射用順鉑購自南京制藥廠。

1.2 方法

1.2.1 建立PDTX模型 從手術(shù)切除的新鮮肺癌中切取富癌組織，迅速置于含有青-鏈霉素的RPMI 1640的離心管中并轉(zhuǎn)運(yùn)至動(dòng)物房中的超凈工作臺(tái)。用含雙抗的RPMI 1640把組織清洗3遍后剪成3 mm×3 mm× 3 mm的塊狀物種植到裸鼠四肢肩背部皮下，每例肺癌標(biāo)本移植3只裸鼠［10］。待癌組織長徑＞10 mm時(shí)用同樣的操作移植到新一批裸鼠形成移植瘤第二代（F2）、三代（F3）。

當(dāng)三代移植瘤（F3）長徑達(dá)到約6 mm時(shí)隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組裸鼠腹腔注射順鉑（5 mg/kg）治療，每周1次，共3周。每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤的長徑（L）代表腫瘤的大小。根據(jù)RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)［11］，腫瘤對(duì)順鉑的反應(yīng)分為完全緩解（CR：所有目標(biāo)病灶消失）、部分緩解（PR：最大長徑縮小≥30%）、疾病穩(wěn)定（SD：最大長徑總和縮小但未達(dá)PR或有增加但未達(dá)PD）、疾病發(fā)展（PD：最大長徑增加≥30%）。本研究中，PD、SD（腫瘤長徑之和增加30%，或者絕對(duì)值增加5 mm以上）視為耐藥，CR、PR視為敏感。

1.2.2 H&E染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè) 患者腫瘤組織和移植瘤組織均以4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片后，分別進(jìn)行常規(guī)H&E染色和免疫組織化學(xué)染色。H&E染色：切片脫蠟至水；蘇木精染色5～10 min，自來水沖洗；鹽酸-酒精分化，自來水沖洗；伊紅染色3～5 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。免疫組織化學(xué)：切片脫蠟至水；微波修復(fù)后，自然冷卻；置于3%H2O2溶液內(nèi)30 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶；PBS清洗3 min×3次，滴加5%的小牛白蛋白10 min，封閉非特異性位點(diǎn)；擦干周圍的血清后，分別滴加兔抗人ERCC1、IGFBP5抗體，4℃冰箱中過夜；第二天室內(nèi)平衡30 min后，PBS清洗3 min×5次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃溫箱內(nèi)孵育20 min；PBS清洗3 min×5次，DAB顯色；蒸餾水沖洗，蘇木精對(duì)比染色細(xì)胞核，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 陽性判定 ERCC1主要于胞核表達(dá)，部分細(xì)胞質(zhì)也有表達(dá)，呈棕黃色。每例切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)1 000個(gè)癌細(xì)胞中陽性細(xì)胞＜10%即為ERCC1（-）。陽性細(xì)胞≥10%即為ERCC1（+）。IGFBP5主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，以癌細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。評(píng)分規(guī)則：對(duì)染色強(qiáng)度評(píng)分（無為0分；弱為1分；中為2分；強(qiáng)為3分）和陽性細(xì)胞率評(píng)分（＜5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；＞50%為3分），兩者乘積為該片評(píng)分值，評(píng)分≤3為IGFBP5（-），評(píng)分＞3為IGFBP5（+）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。成瘤組和未成瘤組年齡比較、長徑采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，分析病理類型、分期、分化、性別與能否成瘤關(guān)系時(shí)采用χ2檢驗(yàn)，比較敏感組和耐藥組ERCC1、IGFBP5的表達(dá)情況時(shí)采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于組織塊法建立的移植瘤模型保持親代腫瘤的結(jié)構(gòu)特征。

H&E染色結(jié)果顯示，移植瘤各代細(xì)胞均為圓形或橢圓形，核大深染，核質(zhì)不均，偶見核仁，呈現(xiàn)病理分裂象。腺癌細(xì)胞胞漿豐富，泡沫感，鱗癌細(xì)胞胞漿少（圖1）。與親代肺癌的組織形態(tài)學(xué)基本一致。

2.2 移植瘤模型的成瘤率及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

共種植84例肺癌標(biāo)本，一代共成瘤27例（總成瘤率32.14%），其中腺癌成瘤9例（成瘤率17.65%）、鱗癌成瘤16例（成瘤率51.61%）、腺鱗癌1例、大細(xì)胞癌1例。二代共成瘤24例（二代總成瘤率88.89%），三代共成瘤23例（三代總成瘤率95.83%）均接近于Laurent等［12］報(bào)道的成瘤水平。通過比較成瘤組與未成瘤組臨床病理參數(shù)發(fā)現(xiàn)，能否一代成瘤與腫瘤的大小、分化、病理類型、性別、分級(jí)相關(guān)，而與患者年齡無關(guān)（表1）。

圖1 親代肺癌組織和相應(yīng)的移植瘤組織保持相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（H&E×100）Figure 1 Hematoxylin and eosin staining shows histopathologic similarity between parental lung tumors and homologous xenograft tumors（H&E×100）

表1 肺癌移植瘤成瘤性與其臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 1 Relationship between tumorigenicity of lung cancer xenografts and clinico-pathological parameters of the patients

2.3 肺癌組織中ERCC1、IGFBP5的表達(dá)水平與原發(fā)性肺癌順鉑耐藥的關(guān)系

在23例三代移植瘤中有20例已經(jīng)完成1個(gè)周期的順鉑化療，其中8例對(duì)順鉑治療敏感，12例對(duì)順鉑耐藥，肺癌移植瘤對(duì)順鉑的敏感率為40%（圖2）。通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)，20例標(biāo)本中ERCC1的陽性率為60%，ERCC1在順鉑耐藥組的表達(dá)水平明顯高于敏感組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。而20例標(biāo)本中IGFBP5的陽性率為70%，IGFBP5的表達(dá)在耐藥組顯著低于敏感組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

圖2 親代肺癌組織中ERCC1和IGFBP5的表達(dá)Figure 2 Expression of ERCC1 and IGFBP5 in tissue samples from lung cancer patients

圖3 第三代移植瘤對(duì)順鉑的敏感性Figure 3 Sensitivity of Passage 3 xenografts to cisplatin therapy

表2 原發(fā)性肺癌順鉑耐藥性與ERCC1、IGFBP5表達(dá)水平的關(guān)系Table 2 Relationship between primary lung cancer cisplatin resistance and the expression levels of ERCC1 and IGFBP5

3 討論

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率占惡性腫瘤之首。為深入研究肺癌的發(fā)生發(fā)展和探索抗腫瘤藥物療效，建立一個(gè)理想的動(dòng)物模型是個(gè)不可或缺的途徑。現(xiàn)已有大量文獻(xiàn)證實(shí)組織塊是優(yōu)于細(xì)胞懸液的良好移植物，用組織塊建立的移植瘤模型不僅保留了親代腫瘤的生物學(xué)特征、染色體特征、腫瘤標(biāo)志物、腫瘤生長微環(huán)境等，還保留了親代腫瘤的組織結(jié)構(gòu)特征［13］。本研究成功建立了27例移植瘤模型，一代能否成瘤與腫瘤的大小、分化、分期、病理類型相關(guān)。通過分析發(fā)現(xiàn)能否成瘤還與性別相關(guān)（P=0.011），男性更易成瘤，這可能是因性別與肺癌病理類型相關(guān)所導(dǎo)致，在肺鱗癌患者中，男性遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于女性（P=0.001）。

目前針對(duì)EGFR、KRAS、VEGF等靶向藥物化療是研究的熱點(diǎn)，由于其對(duì)肺鱗癌的治療效果一般，且費(fèi)用昂貴，限制了其在臨床的普遍使用［14］。目前臨床化療的標(biāo)準(zhǔn)方案仍是以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，臨床上順鉑單藥的有效率約為15%，以順鉑為主的聯(lián)合化療臨床有效率也不超過40%，很多患者都表現(xiàn)為對(duì)順鉑化療藥物的無反應(yīng)性。順鉑與DNA形成加合物后導(dǎo)致DNA損傷，從而啟動(dòng)DNA修復(fù)功能，因此DNA修復(fù)功能的異常是順鉑耐藥的主要機(jī)制之一。ERCC1是含有297個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，與XPF形成的異二聚體具有在5'切割核酸，起著DNA損傷識(shí)別和鏈間切割的關(guān)鍵作用［15］。然而，DNA修復(fù)能力的增加與獲得性耐藥程度不成比例，其在腫瘤固有耐藥細(xì)胞株中顯著增加。因此DNA修復(fù)功能的增加可能并不是獲得耐藥性的根本原因，但卻在原發(fā)耐藥性中發(fā)揮重大作用。本研究對(duì)三代移植瘤進(jìn)行順鉑化療1次/周，共3次（避免誘導(dǎo)耐藥），對(duì)篩選出的敏感組和耐藥組行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ERCC1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)耐藥組的表達(dá)明顯高于敏感組，與最新研究結(jié)果相符合［16］。Welsh等［17］也證實(shí)低水平的切除修復(fù)蛋白（XPA、ERCC1、XPF）與＞80%睪丸癌以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療治愈相關(guān)。雖有文獻(xiàn)報(bào)道ERCC1表達(dá)無法預(yù)測(cè)順鉑為基礎(chǔ)聯(lián)合化療患者的遠(yuǎn)期療效［18］。但患者的遠(yuǎn)期療效和生存率是多因素綜合作用的結(jié)果，長期使用順鉑聯(lián)合化療也可能導(dǎo)致誘導(dǎo)耐藥，因此不能否認(rèn)ERCC1對(duì)原發(fā)性順鉑耐藥的預(yù)測(cè)作用。

IGFBPs以高親和力與IGFs結(jié)合，延長IGFs半衰期，抑制IGFs激活I(lǐng)GFR，從而影響細(xì)胞的生命活動(dòng)。IGFBP5是所有IGFBPs中最保守，與IGFs親和力最高，提示其在細(xì)胞的生理病理中發(fā)揮重大作用［19］。Sun等［20］發(fā)現(xiàn)IGF通路參與調(diào)控肺癌對(duì)順鉑的反應(yīng)。本研究通過免疫組織化學(xué)法對(duì)敏感和耐藥組的IGFBP5表達(dá)情況比較發(fā)現(xiàn)，其在敏感組表達(dá)高于耐藥組。

因標(biāo)本有限只構(gòu)建了1例肺腺鱗癌和1例大細(xì)胞癌模型，未來還需擴(kuò)大樣本量來研究其對(duì)順鉑化療的反應(yīng)。雖然證實(shí)和發(fā)現(xiàn)ERCC1和IGFBP5在順鉑化療敏感組和耐藥組的差異表達(dá)，但其參與調(diào)控順鉑耐藥的具體機(jī)制還有待于深入研究。

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（2015-03-13收稿）

（2015-05-07修回）

（編輯：楊紅欣）

Relationship between cisplatin resistance of primary lung cancer and expression levels of ERCC1 and IGFBP5 in patient-derived tumor xenograft models

Bingxiang ZHAN,Longqiang CHENG,Peng LUO,Ju ZHANG,Baolong WANG
Department of Clinical Laboratory,theAffiliated Provincial Hospital ofAnhui Medical University,Hefei 230001,China. This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81172172).

Baolong WANG;E-mail:wbl196555@163.com

Objective:To establish a lung cancer model of patient-derived tumor xenografts(PDTX)and to explore the relationship between primary cisplatin resistance and ERCC1 and IGFBP5 expression levels.Methods:Lung cancer tissues from 84 patients who underwent surgery were collected and implanted into nude mice.Patient characteristics for the first generation xenografts that were and were not engrafted were compared.Passage 3 xenografts were treated with cisplatin.The expression levels of ERCC1 and IGFBP5 in cisplatin-resistant and cisplatin-sensitive groups were detected using immunohistochemistry assay.Results:The model success rates were 32.14%(27/84)in first-generation xenografts,88.89%(24/27)in second-generation xenografts,and 95.83%(23/24)in third-generation xenografts.The tumorigenicity of first-generation xenografts was correlated with size,differentiation,clinical stage,and histological type.PDTX tumors maintain the histological type of parental tumors through serial passage in nude mice.ERCC1 expression level was significantly higher in the cisplatin-resistant group than in the cisplatin-sensitive group,whereas the IGFBP5 expression level was lower in the cisplatin-resistant group than in the cisplatin-sensitive group.Conclusion:Lung cancer PDTX models were successfully established,and histological characteristics of the primary cancers were retained.Therefore,the models may serve a function in preclinical research of lung tumor biology and for exploring the drug resistance mechanism of tumors.The cisplatin resistance of primary lung cancer may be correlated with the expression level of ERCC1 and IGFBP5 in lung carcinoma.

lung cancer,xenograft model antitumor experiment,ERCC1,IGFBP5,cisplatin-resistance

10.3969/j.issn.1000-8179.20150296

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗(yàn)科（合肥市230001）

*本文課題受國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81172172）資助

王保龍 wbl196555@163.com

展丙香 專業(yè)方向?yàn)榕R床檢驗(yàn)診斷學(xué)研究。

E-mail：847848737@qq.com