BRMS1和Cx43蛋白異常表達與甲狀腺癌發生發展關系的研究*

吳宇 劉輝

·臨床研究與應用·

BRMS1和Cx43蛋白異常表達與甲狀腺癌發生發展關系的研究*

吳宇 劉輝

目的：探索甲狀腺癌組織中乳腺癌轉移抑制基因1（breast cancer metastasis suppressor 1，BRMSl）和細胞縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）的表達與患者臨床資料、預后的關系。方法：收集2009年1月至2013年6月間福建省腫瘤醫院頭頸外科采用免疫組織化學SP法檢測195例組織石蠟標本中BRMS1和Cx43蛋白表達情況，其中包括甲狀腺癌90例，甲狀腺腺瘤45例，結節性甲狀腺腫和正常甲狀腺組織各30例。結果：甲狀腺癌組織中BRMS1和Cx43蛋白的陽性表達率分別為56.7%（51/90）和41.1%（37/ 90），均顯著低于其他3組組織標本（均P＜0.001）。Cx43蛋白在不同病理類型組織中陽性表達率差異有統計學意義（均P＜0.05）：乳頭狀癌61.9%，髓樣癌27.8%，濾泡狀癌27.3%，未分化癌12.5%；而BRMS1的表達未見顯著性差異。BRMS1和Cx43蛋白在淋巴結轉移患者癌組織中表達率均顯著低于無淋巴結轉移患者（均P＜0.001）；亞組分析顯示隨著腫瘤TNM分期的改變，BRMS1和Cx43蛋白的陽性表達率逐漸下降，且兩種蛋白表達呈正相關（r=0.494，P=0.032）。結論：BRMS1和Cx43蛋白在甲狀腺癌組織中表達均顯著下降，且其表達差異與甲狀腺癌的浸潤轉移、腫瘤惡性程度及TNM分期有關，二者聯合檢測或有利于復發轉移的判斷。

甲狀腺癌 乳腺癌轉移抑制基因1 連接蛋白43 免疫組織化學

作為內分泌系統中常見的惡性腫瘤，甲狀腺癌發病率表現出明顯增高的趨勢［1］。甲狀腺癌的發生機制復雜，其轉移也涉及多基因和蛋白的相互作用。因此，探索同甲狀腺癌復發轉移相關的蛋白，對于患者療效評估和預后判斷意義重大。近來諸多研究顯示甲狀腺癌細胞間通訊異常與甲狀腺癌的轉移關系極為密切，細胞縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）和乳腺癌轉移抑制基因1（breast cancer metas﹣tasis suppressor 1，BRMSl）廣泛參與調節腫瘤細胞的增殖和分化、惡性表型的進展及侵襲轉移［2-3］。本研究采用免疫組織化學SP法檢測BRMS1和Cx43蛋白在甲狀腺癌組織中的表達情況，并分析其潛在的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2009年1月至2013年6月間于福建省腫瘤醫院行手術切除甲狀腺石蠟組織標本195例，其中包括90例甲狀腺癌，30例結節性甲狀腺腫，45例甲狀腺腺瘤，30例甲狀腺正常組織（來源良性病變甲狀腺次全切除的標本）。90例甲狀腺癌中，男性38例，女性52例，平均年齡47（20～73）歲。組織標本收集前均未進行放化療或免疫治療等治療手段，所有標本均為常規石蠟切片，經HE染色后由本院兩位副高級職稱以上病理科醫生對組織進行病理分型：乳頭狀癌42例，濾泡癌22例，髓樣癌18例，未分化癌8例。腫瘤分期依據國際抗癌協會聯盟（UICC）2002年制定的TNM分期（Ⅰ～Ⅳ期病例數分別為13、28、31和18例）。本研究通過福建省腫瘤醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 試劑和方法 實驗試劑主要為兔抗人BRMS1單克隆抗體和Cx43多克隆抗體，購自美國Santa Cruz公司，BRMS1和Cx43工作液濃度均為1∶100。免疫組織化學SP試劑盒和DAB試劑盒均購自上海長島生物公司。手術切除后的組織標本，先用10%中性福爾馬林溶液固定，然后石蠟包埋。每例標本切片厚度約4 μm，采用SP法進行免疫組織化學染色（操作步驟參考試劑盒詳細說明書），分為陰性和陽性對照：已知的乳腺癌陽性片作為陽性對照；PBS液代替一抗作為陰性對照組。

1.2.2 免疫組織化學判斷標準 BRMS1和Cx43蛋白陽性細胞著色主要位于胞質或胞核內，顯色呈淡黃色至棕黃色（染色深淺需要清除背景著色的影響）等。BRMS1和Cx43蛋白結果判斷將結合染色強度評分和陽性細胞率：1）無著色（或基本不著色）、淡黃色、黃色及棕褐色分別記為0、1、2、3分；2）每張切片選擇10個高倍視野（×400），各計數100個細胞，計算出陽性細胞表達的百分率（%），＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%以上為4分。免疫組織化學結果根據染色陽性細胞百分率和染色強度分別評分：0分為陰性（-）；1～2分為弱陽性（+），3～6分為中等陽性（++），＞6分為強陽性（+++）。染色強度與陽性細胞百分比的乘積＞1分計為免疫反應陽性（+）。免疫組織化學染色結果的鑒定均由本院兩位病理科專業醫師雙盲閱片進行評分后進行統計（圖1，2）。

圖1 BRMS1免疫組織化學染色判斷圖譜Figure 1 Immunohistochemical staining for judging the BRMS1 map

圖2 Cx43免疫組織化學染色Figure 2 Immunohistochemical staining of Cx43

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行實驗數據分析。BRMS1蛋白表達陽性患者例數、Cx43蛋白表達陽性患者例數在不同組織中的比較為計數資料，組內及組間比較采取χ2檢驗。運用秩相關的Spearman方法分析BRMS1和Cx43蛋白表達的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BRMS1和Cx43蛋白在甲狀腺癌、腺瘤、甲狀腺腫及正常組織中的表達

免疫組織化學染色結果提示BRMS1和Cx43主要分布于胞質和胞核，呈彌漫性分布（表1）：BRMS1蛋白的表達在甲狀腺癌組織、甲狀腺腺瘤組織、結節性甲狀腺腫組織及正常組織中均有顯著性差異（χ2=32.191，P＜0.001）。在甲狀腺癌組織中BRMS1蛋白的陽性表達率為56.7%（51/90），顯著低于腺瘤（χ2=14.178，P＜0.001）、結節性甲狀腺腫（χ2=10.989，P=0.001）和正常組織（χ2=16.200，P＜0.001）。Cx43蛋白的表達在甲狀腺癌組織、甲狀腺腺瘤組織、結節性甲狀腺腫組織及正常組織中也均有顯著性差異（χ2=58.658，P＜0.001），且Cx43蛋白在甲狀腺癌組織中的陽性表達率為41.1%（37/90），同樣顯著低于腺瘤（χ2=21.815，P＜0.001）、結節性甲狀腺腫（χ2=24.714，P＜0.001）和正常組織（χ2=31.642，P＜0.001，表1）。

2.2 甲狀腺癌BRMS1和Cx43蛋白的表達與臨床病理因素的關系

相比于無淋巴結轉移的甲狀腺癌患者，有淋巴結轉移的癌組織中BRMS1、Cx43蛋白陽性表達率均顯著下降（BRMS1：33.3%vs.77.1%；Cx43：26.2%vs. 54.2%），差異有統計學意義（均P＜0.001，表2）。Cx43蛋白在乳頭狀癌、髓樣癌、濾泡狀癌以及未分化癌組織中的表達率分別為61.9%、27.8%、27.3%和12.5%，差異有統計學意義（均P＜0.05），而BRMS1的表達在不同病理類型癌組織中卻未見顯著性差異。本研究同時發現腫瘤TNM分期和BRMS1蛋白間關系緊密，而與Cx43蛋白中關系不大。進一步亞組分析顯示BRMS1的陽性表達率隨著腫瘤TNM分期（Ⅰ～Ⅳ期）的提高有明顯的下降趨勢，而在Cx43蛋白中卻未觀察到這一趨勢（表3）。

表1 BRMS1和Cx43蛋白在甲狀腺癌、腺瘤、甲狀腺腫及正常組織中的表達 例（%）Table 1 BRMS1 and Cx43 protein expression in thyroid carcinoma，adeno﹣ma，goiter，and normal tissues

2.3 BRMS1和Cx43蛋白表達的相關性分析

90例甲狀腺癌患者中，BRMS1和Cx43蛋白表達均為陽性21例，均為陰性23例；BRMS1陽性但Cx43陰性30例，BRMS1陰性但Cx43陽性16例。Spearman相關性分析顯示這兩種蛋白表達呈正相關（r=0.494，P=0.032，表4）。

表2 BRMS1和Cx43蛋白表達與甲狀腺癌臨床病理因素的關系 例（%）Table 2 Relationship of the Cx43 and BRMS1 expression with clinicopathologic factors of thyroid cancer

表3 BRMS1和Cx43蛋白表達與腫瘤分期的關系Table 3 Relationship of the BRMS1 and Cx43 expression with tumor staging

表4 BRMS1和Cx43蛋白表達的相關性分析Table 4 Correlation analysis of BRMS1 and Cx43 expression

2.4 BRMS1和Cx43蛋白表達與腫瘤復發

90例甲狀腺癌患者的隨訪采用電話隨訪或門診隨訪，隨訪截至2015年3月（其中失訪或臨床資料不完整11例）。在完成隨訪的79例患者中，3年生存率為97.5%（77/79），無復發生存率為89.9%（71/79）。BRMS1蛋白陽性和陰性患者3年無復發生存率分別為100.0%（45/45）和76.5%（26/34）。Cx43蛋白陽性和陰性患者3年無復發生存率分別為90.6%（29/32）和89.4%（42/47）。復發的8例患者BRMS1蛋白全部陰性表達，而Cx43蛋白陽性、陰性表達的分別為3例和5例。

3 討論

作為細胞間一種普遍存在的通訊方式，細胞縫隙連接（gap junction，GJ）廣泛參與調節細胞增殖分化、凋亡及內環境的穩定等生物學行為。近年來新發現的Cx43是人體內重要的細胞縫隙連接蛋白，研究已證實許多惡性腫瘤的發生發展、浸潤轉移與Cx43基因表達異常所導致的細胞間隙連接通訊（gap junctional intercellular communication，GJIC）功能改變有關［4］。有研究［5］發現Cx43蛋白可作為乳腺癌早期診斷較好的標記物，其表達水平改變可反映乳腺惡性腫瘤的浸潤進展。李國等［6］發現肺腺癌中Cx43蛋白和基因表達水平的差異與癌組織病理類型、淋巴結有無轉移及腫瘤分期密切相關，可能是影響肺腺癌患者預后的重要分子指標之一。王化修等［7］發現Cx43在鼻咽癌的癌前病變組織中的表達明顯下調。高飛等［8］同樣發現骨肉瘤組織中Cx43蛋白的低表達。

甲狀腺癌細胞的凋亡、遷徙轉移等生物學特性和細胞間隙連接通訊關系密切。Jensen等［9］發現通過上調Cx43在甲狀腺癌細胞中的表達，會顯著提高該細胞對腫瘤壞死因子的反應性，從而促進癌細胞凋亡。Leithe等［10］認為甲狀腺癌細胞逃避胸苷激酶介導的旁觀者殺傷效應的分子機制與Cx43表達改變引起的GJIC受損有關。本研究通過免疫組織化學技術觀察發現甲狀腺癌組織中Cx43蛋白表達水平顯著下降，且其表達差異同淋巴結有無轉移及組織病理分型顯著相關。同樣觀察到，不同病理類型的甲狀腺癌組織中Cx43蛋白表達水平、強度差異一定程度上提示甲狀腺癌中細胞縫隙連接通訊功能的下降，促進了異常的上皮細胞的增殖分化，使得細胞出現惡性表型，從而導致甲狀腺癌的發生發展，甚至浸潤轉移。

影響惡性腫瘤細胞浸潤轉移的因素除了細胞縫隙連接蛋白表達改變之外，還與腫瘤轉移相關基因的異常表達密切相關。BRMS1基因是最開始在研究乳腺癌的轉移機制時發現［11］，近年研究提示該基因在存在轉移的其他惡性腫瘤組織中也顯著低表達或表達缺失，如前列腺癌［12］、胃癌［13］等。BRMS1抑制腫瘤轉移的機制涉及多種途徑，其中重要的途徑之一為恢復細胞間縫隙連接通訊。Saunders等［14］通過上調BRMS1在具有轉移潛能的人乳腺癌細胞株MDA-MB-435發現，細胞連接蛋白Cx43表達水平也顯著升高，細胞間的縫隙連接通訊恢復正常，從而使得乳腺癌細胞的表型趨向于正常乳腺組織。李曉瑜等［15］發現喉癌中Cx43下調的患者容易發生頸部淋巴結轉移，或許與BRMS1抑制轉移有關。

為驗證甲狀腺癌組織中Cx43蛋白的表達是否與BRMS1表達有一定的相關性，本研究同時檢測了癌組織中BRMS1蛋白的表達。結果顯示癌組織中BRMS1表達水平同樣顯著下降，表達差異與淋巴結轉移和TNM分期等臨床因素相關，結合患者的生存資料同樣觀察到BRMS1蛋白水平和甲狀腺癌患者的復發轉移間有一定的相關性。另外，本研究還觀察到甲狀腺癌組織中BRMS1和Cx43蛋白表達呈一定的正相關，或許提示其除在調節甲狀腺癌細胞間縫隙連接及其惡性表型的轉變中扮演重要角色外，同樣共同參與和調節了癌細胞的浸潤轉移。目前鮮見對甲狀腺癌組織中BRMS1和Cx43臨床價值的研究，本研究為進一步明確甲狀腺癌轉移的分子機制及其后期患者診治、預后判斷提供了有力的依據。

綜上所述，BRMS1和Cx43不僅參與甲狀腺癌的發生發展，同樣參與調節癌細胞轉移的進程。聯合檢測甲狀腺癌組織中這兩種基因的表達水平有望成為甲狀腺癌診治新靶點及其預后判斷的分子標記物。為進一步明確BRMS1和Cx43在甲狀腺癌轉移中的作用機制，本研究后期或將考慮從細胞層面對其進行驗證。

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（2015-03-30收稿）

（2015-05-13修回）

（編輯：邢穎）

Abnormal expression of BRMS1 and Cx43 protein in thyroid cancer occurrence and progression

Yu WU,Hui LIU
Department of Head and Neck Surgery,Fujian Province Cancer Hospital,Teaching Hospital of Fujian Medical University. This work was supported by the Scientific Research Project of Fujian Provincial Health Bureau(No.2012-2-14).

Hui LIU;E-mail:279908653@qq.com

Objective:To investigate the protein expression levels of breast cancer metastasis suppressor 1(BRMS1)and Connexin 43(Cx43)in thyroid cancer and their correlation with clinicopathologic parameters.Methods:Immunohistochemistry Streptavidin-Peroxidase method was used to detect the BRMS1 and Cx43 protein expression in 195 tissue samples,including 90 cases with thyroid carcinoma,45 cases with thyroid adenoma,30 cases with nodular goiter,and 30 cases with normal thyroid glands.Results:The positive rates of BRMS1 and Cx43 expression was 56.7%(51/90)and 41.1%(37/90)in thyroid carcinoma,respectively,which are significantly lower than the rates in thyroid adenoma,nodular goiter,and normal thyroid gland tissues(P＜0.001).Of the three pathological types of thyroid cancer,the positive expression rate of Cx43 was 61.9%in papillary carcinoma,27.8%in medullary carcinoma,27.3% in follicular carcinoma,and 12.5%in undifferentiated carcinoma.Statistical differences in the BRMS1 expression among papillary carcinoma and the other pathological types were also noted.Unlike the patients without lymph node metastasis,the positive expression of BRMS1 and Cx43 proteins were both significantly low among patients suffering from nodal metastasis.Subgroup analysis shows that the positive expression of BRMS1 and Cx43 protein gradually decreased with TNM staging.In addition,a positive correlation was observed between the BRMS1 and Cx43 protein expression(r=0.494,P=0.032).Conclusion:The decreased expression of BRMS1 and Cx43 proteins is significantly correlated with the metastasis of thyroid cancer and malignant grade.The combined detection of the two proteins can be ideal biomarkers for judging the prognosis of thyroid carcinoma.

thyroid cancer,breast cancer metastasis suppressor 1,connexin 43,immunohistochemisty

10.3969/j.issn.1000-8179.20150322

福建醫科大學教學醫院，福建省腫瘤醫院頭頸外科（福州市350014）

*本文課題受福建省衛生廳青年科研計劃（編號：2012-2-14）資助

劉輝 279908653@qq.com

吳宇 專業方向為頭頸腫瘤外科治療。

E-mail：429146964@qq.com