CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中比例與乳腺癌遠處轉移關系

王斌 熊健 只向成

·臨床研究與應用·

CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中比例與乳腺癌遠處轉移關系

王斌①熊健②只向成①

目的：旨在探討CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中的比例與乳腺癌遠處轉移之間關系。方法：隨機選取2003年1月至2004年10月于天津醫科大學腫瘤醫院確診的乳腺癌患者60例，并將其分為30例轉移組及30例非轉移組（對照組）。免疫組織化學雙重染色技術檢測60例患者石蠟切片中CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中所占比例，分析其與遠處轉移之間關系。結果：轉移組與對照組中CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中所占比例具有顯著性差異（χ2=11.334，P＜0.05）。骨轉移中CD44+/ CD24-細胞在乳腺癌組織中比例有顯著性差異（χ2=9.250，P=0.01）。CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中5年無瘤生存期比例有顯著性差異（χ2=8.058，P=0.005）。結論：CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中所占比例與乳腺癌遠處轉移密切相關，特別是骨轉移。

CD44+/CD24-細胞 乳腺癌干細胞 遠處轉移 骨轉移

腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSC）是一種特殊類型的干細胞，具有高度增殖能力與自我更新能力，也具有多向分化的潛能［1］。乳腺腫瘤由不同種群的細胞構成，但目前對于其導致腫瘤發展的理論仍不清楚，其一認為所有種群的細胞通過累計突變，均具有腫瘤源性；其二則認為一少部分細胞，具有干細胞樣特點，能夠自我更新及多向分化，最終發展成為腫瘤［2］。乳腺癌干細胞理論對乳腺癌治療有重要意義，多采用殺傷增殖中細胞，但乳腺癌干細胞的細胞周期較慢、增殖不活躍，目前的治療方案對乳腺癌干細胞的效果不佳，這有可能是導致乳腺癌治療失敗，造成復發及轉移的原因之一。因此，將乳腺癌干細胞體內、體外研究的結果應用于臨床非常重要。本研究旨在闡明CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中比例與遠處轉移的關系，分析其對預后的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例選擇 2003年1月至2004年10月于天津醫科大學腫瘤醫院收治確診為乳腺癌遠處轉移的病例為171例。53例于本院術后病理確診為乳腺癌，選取其中資料及組織標本完整的病例30例為轉移組，均為女性，年齡30～69歲，中位年齡47.5歲。同時隨機選取本院乳腺科2003年1月診治的乳腺癌患者30例作為對照組，隨訪10年均未發生局部復發及遠處轉移，年齡31～75歲，中位年齡49.5歲。所選病例均為單側乳腺癌，該研究獲得本院倫理委員會認可。隨機選取60例轉移組與對照組患者臨床病理資料見表1。

1.2 方法

選取轉移組與對照組60例石蠟包埋組織標本進行切片，應用免疫組織化學雙重染色技術對CD44及CD24細胞進行染色。

1.2.1 免疫組織化學S-P法單染對照 為與CD44和CD24細胞免疫組織化學雙重染色形成對照，證實雙染的可信程度，即在同一標本連續切片，選取兩張連續石蠟切片，分別對CD44及CD24細胞進行單染，然后和雙染切片進行對比。單染過程中，一抗仍為CD44（clone 156-3C11）和CD24（clone SN3b），均購自美國Neomarkers公司。實驗前蠟塊處理、切片，抗原修復等過程均與雙染相同，單染CD44細胞時，DAB顯色后即行蘇木精染核，然后行鹽酸酒精分化，氨水返藍，于80%、95%、無水酒精中依次將切片浸泡10 min進行脫水，將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10 min，取出切片行樹脂膠封片。單染CD24細胞時，選用AEC染色后仍用水溶性封片劑封片。結果顯示，單染對照與雙染結果相同。

1.2.2 病理結果判定 光鏡下雙染結果由兩位病理醫師進行判定計數，采用雙盲法。CD44細胞DAB染色顯示褐色，為細胞膜著色。CD24細胞AEC染色顯示紅色，為細胞膜及胞質著色。CD44+/CD24-細胞顯示細胞膜著褐色，而CD24+細胞的細胞膜、胞質顯示紅色；CD44+/CD24+細胞的胞膜顯示棕色，胞質顯示紅色。可評估CD44+/CD24-細胞在整個腫瘤區域百分比。

1.3 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。計數資料間的比較采用χ2檢驗，單因素生存分析采用Ka﹣plan-Meier方法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CD44+/CD24-細胞的鑒別

30例轉移組及30例對照組行免疫組織化學雙重染色，CD44+細胞在乳腺癌組織中表達呈褐色，CD24+細胞表達呈紅色。因此，CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中表達呈褐色（圖1A），區別于單純CD24+細胞胞膜呈紅色表達，與CD44+/CD24+細胞胞膜表達呈棕色（圖1B）也有所區別。CD24+細胞的胞質也呈紅色表達，更可區分CD44+/CD24-細胞與CD44+/CD24+細胞。轉移組與對照組兩組的CD44+/ CD24-細胞在乳腺癌組織中比例均由病理醫師鏡下觀察計數。

圖1 CD44+/CD24-與CD44+/CD24+細胞的免疫組織化學雙重染色比較Figure 1 Comparison of double-staining results for CD44+/CD24-cells and CD44+/CD24+cells

2.2 轉移組與對照組中CD44+/CD24-細胞比例比較

鏡下行每張切片中CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中百分比計數，轉移組中為0～80%，而對照組中為0～60%。將該百分比劃分為低度表達組（0～25%）、中度表達組（26%～50%）、高度表達組（＞50%）3個組。轉移組中低度表達組為26.7%（8/ 30）、中度表達組為60.0%（18/30）、高度表達組為13.3%（4/30），中位百分數為40.0%；對照組中低度表達組為70.0%（21/30）、中度表達組為23.3%（7/ 30）、高度表達組為6.7%（2/30），中位百分數為10.0%。CD44+/CD24-細胞在兩組乳腺癌組織中百分比之間的比較存在顯著性差異（χ2=11.334，P＜0.05，表2）。

表1 60例乳腺癌患者臨床病理資料Table 1 Clinical data on 60 breast cancer cases

2.3 CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中百分比與骨轉移的關系

CD44+/CD24-細胞在轉移組與對照組的乳腺癌組織中百分比之間比較存在顯著性差異，與遠處轉移相關。30例轉移組中骨轉移20例（66.7%）、肝轉移5例（16.7%）、肺轉移4例（13.3%）、腦轉移1例（3.3%）。在骨轉移中CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中百分比有顯著性差異（χ2=9.250，P=0.01）。30例轉移組中CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中百分比與骨轉移的關系見表3。

表2 轉移組與對照組CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中百分比的比較Table 2 Comparison of the metastasis and control groups in terms of the prevalence of CD44+/CD24-cells

無瘤生存期在中、高度表達組為12個月、低度表達組為25個月，中位無瘤生存期為15個月，中、高度表達組5年無瘤生存期明顯低于低度表達組，CD44+/ CD24-細胞在乳腺癌組織中百分比與5年無瘤生存期存在顯著性差異（χ2=8.058，P=0.005，圖2）。CD44+/ CD24-細胞在乳腺癌組織中百分比與總生存期無顯著性差異（χ2=2.002，P=0.157，圖3）。

圖2 CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中百分比與5年無瘤生存期曲線Figure 2 Prevalence of CD44+/CD24-cells in breast cancer tissue and five-year DFS curves

圖3 CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中百分比與總生存期曲線Figure 3 Prevalence of CD44+/CD24-cells in breast cancer tissue and overall survival curves

3 討論

CSC具有高度增殖能力、自我更新能力及多向分化的潛能，是一種特殊類型的干細胞。CSC增殖過程是通過不對稱分裂，由一個CSC分裂形成一個新的CSC及一個可最終分化為包括腫瘤細胞在內的各種細胞的子細胞，其結果是維持CSC數目穩定并發生腫瘤［1］。乳腺癌干細胞理論對乳腺癌治療的重要性［3-5］越來越受到重視，現多采用對增殖過程的細胞殺傷治療。通常認為乳腺癌干細胞的細胞周期緩慢，增殖不活躍，因此乳腺癌干細胞治療的效果有限［6］，可能是造成乳腺癌治療失敗引起復發轉移的原因之一。乳腺癌干細胞應用于臨床的研究表明，CD44+/ CD24-細胞在癌組織中比例對乳腺癌局部復發無影響，但與遠處轉移可能有關［7］。有研究顯示，存在CD44+/CD24-亞細胞群的細胞系比其他細胞系更具有侵襲性，乳腺癌13個細胞系中MDA-MB-231、MDAMB-436、Hs578T、SUM1315和HBL-100細胞系的CD44+/CD24-細胞比例均超過30%，其中MDA-MB-231細胞系與遠處轉移有關［8］。

表3 CD44+/CD24-細胞在腫瘤組織中百分比與骨轉移的關系Table 3 Relationship between the prevalence of CD44+/CD24-cells and osseous metastasis

幾十年前腫瘤干細胞起源的問題就被提出，但因當時對于干細胞研究的實驗設備較少，不能夠提供充分可靠的實驗證據而被擱置［9-11］。近幾年隨著實驗技術的發展，以及對之前搜集數據的重新評價，才得以從干細胞層次上對癌癥進行研究。腫瘤干細胞具有抵御傳統抗腫瘤治療的殺傷能力，進而出現遠處轉移［2，12-13］，腫瘤發生遠處轉移是一個復雜的過程，不僅包括浸潤，而且還要在遠隔部位進行定位、增殖［14］。乳腺癌中能夠形成遠處轉移的細胞應具有表達浸潤/遠處轉移的相關基因、浸潤性、遠隔部位定位并增殖三個特點。研究發現，乳腺癌細胞系中具有高比例CD44+/CD24-細胞的細胞系具有高度浸潤的特點，并且能夠浸潤到基質中［9］。因此對于乳腺癌中CD44+/CD24-細胞的研究就顯得格外重要，目前主要研究是針對CD44+/CD24-細胞在診斷中的重要性，以及通過臨床實驗研究的乳腺癌干細胞理論應用于臨床實際的可行性。

本研究應用免疫組織化學雙重染色方法，對在體內、體外已證實的CD44+/CD24-細胞是否存在于乳腺癌組織石蠟包埋切片中進行鑒別。國外曾有關于這方面的報道［9］，CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中的比例與乳腺癌進展、復發無必然相關性，與本研究中CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中比例無顯著性差異是一致的。同時本研究證明CD44+/CD24-細胞在乳腺癌組織中比例與遠處轉移具有相關性，特別是對于骨轉移，顯示了CD44作為遠處轉移定位受體的重要意義，CD44表達的細胞系具有高度的細胞活動性［15］。本研究結果顯示，CD44+/CD24-細胞的抗原性雖不能完全反映乳腺上皮腫瘤的腫瘤特性，但CD44+/CD24-細胞有可能成為腫瘤遺傳細胞的一個亞細胞群。在動物實驗中［2］，分離出的CD44+/CD24-細胞1/9不具有腫瘤遺傳特點。在個別病例中甚至出現CD24+細胞顯示腫瘤遺傳性的特點［2］，由于腫瘤遺傳性包括復雜的生物學機制，單細胞可能不能充分證明其具有腫瘤遺傳性。CD44+/CD24-表達的細胞是乳腺癌中具有腫瘤遺傳性的細胞，但在腫瘤遺傳性中表現的功能關聯性尚不清楚。

鑒于干細胞在乳腺癌中的重要性，繼續研究乳腺癌干細胞其他的特點是必要的，對治療乳腺癌以及發現新的靶向治療藥物非常重要。

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（2014-09-10收稿）

（2015-05-19修回）

Relationship between the prevalence of CD44+/CD24-cells and distant metastasis in breast cancer

Bin WANG1,Jian XIONG2,Xiangcheng ZHI1
No.2 Department of Breast Cancer,1Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Treatment,Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy,Tianjin Medical University,Ministry of Education,Tianjin 300060,China;2General Surgery Department,Ge Zhouba Center Hospital,Yichang 443002,China.

Xiangcheng ZHI;E-mail:86496007@qq.com

Objective:To examine the relationship between the prevalence of CD44+/CD24-cells and distant metastasis in breast cancer tissue.Methods:A total of 60 breast cancer patients who had been admitted to Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital between January 2003 and October 2004 were randomly selected.Our cases were divided into metastasis and non-metastasis (control)groups.The CD44+/CD24-cells were identified through double-staining immunohistochemistry.Then,the prevalence of CD44+/CD24-cells in breast cancer tissue was calculated.Information was obtained regarding the relationship between this prevalence and distant metastasis.Results:Differences between the metastasis and control groups are significant in terms of the prevalence of CD44+/CD24-cells in breast cancer tissue(χ2=11.334,P＜0.05).The osseous metastasis group also deviated considerably from the control group in this respect(χ2=9.250,P=0.01).This prevalence is significant in five-year disease-free survival(χ2=8.058,P=0.005).Conclusion:The prevalence of CD44+/CD24-cells in breast cancer tissue is associated with distant metastasis,especially with osseous metastasis.

CD44+/CD24-cells,breast cancer stem cells,distant metastasis,osseous metastasis

10.3969/j.issn.1000-8179.20141554

①天津醫科大學腫瘤醫院乳腺二科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，乳腺癌防治教育部重點實驗室（天津市300060）②湖北省宜昌市葛洲壩中心醫院普外科

只向成 86496007@qq.com

王斌 專業方向為乳腺腫瘤臨床治療及基礎研究。

E-mail：jeffrewang@hotmail.com