肝細胞性肝癌組織浸潤淋巴細胞表型與分布研究

史炯 董瓊珠 欽倫秀 孫海晶 賈戶亮

·臨床研究與應用·

肝細胞性肝癌組織浸潤淋巴細胞表型與分布研究

史炯①董瓊珠②欽倫秀②③孫海晶②賈戶亮③

目的：肝細胞性肝癌組織浸潤淋巴細胞與外周血T細胞表型可能與腫瘤進展及預后相關，本研究檢測肝癌患者組織及外周血T細胞表型與分布，分析淋巴細胞表型變化與預后的關系。方法：分析2007年10月至12月中山醫院147例肝癌及癌旁組織浸潤淋巴細胞表型（T細胞或B細胞表面標志物：CD3、CD8、CD4、CD20、CD19、Foxp3），表型與臨床病理特征及預后的關系；檢測26例肝癌外周血CD3、CD8、CD4+T細胞數量并其比例變化。結果：癌巢內腫瘤浸潤細胞明顯少于癌周組織（P＜0.01），癌周淋巴細胞主要分布于癌旁正常肝組織、匯管區，其與患者肝炎病史及肝硬化相關，表型以CD3+T細胞為主，其中又以CD8+細胞毒性T細胞為主；CD4染色在多數病例為陰性，Foxp3僅在個別病例（15/109）呈陽性。腫瘤浸潤淋巴細胞B細胞標志CD20、CD19均為陰性。腫瘤組織內CD8+T細胞浸潤數量與預后正相關，而癌周浸潤淋巴細胞數目與患者轉移及復發無顯著關系。結論：肝癌腫瘤浸潤細胞在癌巢內明顯少于癌周組織，腫瘤及癌周浸潤細胞以CD8+細胞毒性T細胞為主。腫瘤組織內CD8+T細胞浸潤數量與預后相關，而癌周浸潤淋巴細胞數量與患者轉移及復發無顯著關系。

腫瘤浸潤淋巴細胞 肝癌 表型 預后

肝細胞性肝癌癌旁組織免疫炎癥相關細胞因子與腫瘤進展及預后關系密切，可以作為預后預測因子，但是腫瘤浸潤淋巴細胞及癌旁免疫微環境中免疫細胞的狀態變化，及其對細胞因子的影響還不清楚。本研究擬初步分析肝癌患者浸潤淋巴細胞組織分布與表型及外周血淋巴細胞表型變化與預后的關系，為進一步構建腫瘤免疫微環境分子預測體系提供組織學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本采集 血液標本來自中山醫院肝外科2007年10月至12月收治的手術治療患者肝細胞肝癌患者26例，留取術前靜脈血200 μL。其中：男∶女為24∶2；平均年齡52.4（43～73）歲；患者均有乙型肝炎病毒感染，均接受了R0切除術，術后病理證實，術后隨訪2年。所有患者6個月內均未接受除手術其他任何抗腫瘤治療及免疫治療。本研究通過復旦大學中山醫院醫學倫理委員會批準。

1.1.2 免疫組織化學所需試劑 抗體：鼠抗人CD3、鼠抗人CD4、鼠抗人CD19、鼠抗人CD20、鼠抗人Foxp3均購自美國Chemicon生物公司；鼠抗人CD8購自中國武漢博士德生物工程有限公司。鼠兔通用EnVisionTM檢測試劑盒購自Peroxidase/DAB（DAKO，丹麥）、10%正常羊血清購自中國福州邁新生物試劑公司。免疫組織化學染色依試劑盒提供常規方法進行。

1.2 方法

1.2.1 判定標準 由于淋巴細胞表型抗體均表達于細胞膜，免疫組織化學讀片判定標準為胞膜棕黃色顆粒狀沉積物且相對一致的染色強度判定為陽性，全片均無一淋巴細胞表達定為陰性。

1.2.2 流式細胞儀檢測淋巴細胞分型實驗 所取標本均為術前清晨空腹的外周靜脈血200 μL，EDTA抗凝并混勻。密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。流式細胞儀分選系統檢測，以前向散射為橫坐標，縱向散射為縱坐標做散點圖，設定淋巴細胞門。以同型對照確定各熒光的分界游標。每個樣品管收集10 000個淋巴細胞，自帶CenQuest軟件分析結果，分別以CD3+T細胞/淋巴細胞、CD3+CD4+T細胞/淋巴細胞、CD3+CD8+T細胞/淋巴細胞百分比代表外周血CD3+T細胞、CD4+T細胞及CD8+T細胞的表達頻數，同時計算CD3+CD4+/CD3+CD8+反映外周血CD4+/CD8+比值。

1.3 統計學方法

應用SPSS 12.0軟件統計學分析。計數資料用卡方檢驗進行組間比較，計量資料則根據數據是否呈正態分布分別采用t檢驗和單因素方差分析或采用秩和檢驗。Cox比例風險模型用于單因素或多因素分析，分析各因素與HCC患者無瘤生存率（disease-free survival，DFS）及總體生存率（overall survival，OS）的關系。

2 結果

2.1 臨床病理資料分析

147例肝癌患者，男性131例，女性16例；平均年齡為52.54±11.17歲，124例（84.35%）＜60歲。85例患者（57.82%）為Child-PughA期。27例患者肝硬化大結節（硬化結節＞3 cm）；55例（37.4%）術后復發，40例（27.2%）死亡。多結節患者數20例，78例（53.1%）無包膜或包膜不完整。78例（53.1%）患者AFP＜20 ng/mL。門靜脈（包括鏡下癌栓）癌栓者86例（64.7%）；腫瘤最大徑＞5 cm的患者為91例（61.90%）。病理組織學分期Ⅰ～Ⅱ期90例（61.22%）。

各項臨床病理指標在復發與非復發組、死亡與生存組臨床病理之間差異（表1）。病理分期在是否復發（P=0.009）、死亡（P=0.02）的病例組差異有統計學意義。有無包膜僅對總生存（P=0.032）有顯著性影響。AFP＞20 ng/mL的患者比AFP未升高更易復發（P=0.041），術前門靜脈主支癌栓對于復發和死亡均有顯著性意義，P值分別為0.001和0。

單因素風險比例回歸風險比例模型中腫瘤大小（P=0.014）、TNM分期（P=0.001）、術前AFP（P=0.029）、有無包膜（P=0.005）對生存風險比值比均＞2，但是影響術后生存多因素分析中僅有組織學分期（P=0.02）、TNM分期（P=0.002）、癌栓（包括鏡下癌栓）（P＜0.001）有顯著性意義，其中術前癌栓多因素風險回歸OR=5.810（95%CI：2.272～14.858，表2）。

2.2 原發性肝癌患者腫瘤組織T淋巴細胞亞群比例變化

腫瘤浸潤淋巴細胞主要分布于癌周及癌旁正常組織間質（圖1），僅有55例（37.4%）肝癌腫瘤內每高倍視野（×40）大于100個淋巴細胞浸潤。浸潤細胞以CD3+T細胞為主，其中以CD8+T細胞為主（圖2）；CD4染色在多數病例為陰性，Foxp3僅在個別病例（15/109）存在，由于分層后各組例數太少無法統計。腫瘤浸潤淋巴細胞B細胞表面標志CD20、CD19在所有病例均為陰性。癌旁組織中CD3+T細胞數量比癌組織明顯增多，差異在復發組之間無顯著性意義（P＞0.05），而癌組織CD8+T細胞數量同樣較癌旁組織少，差異在復發組之間有統計學意義。癌旁及癌組織內CD4+T比值極低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 肝癌患者外周血淋巴細胞CD3、CD8、CD4分型

肝細胞癌患者外周血CD4+細胞計數/CD8+細胞計數=1.167±1.04、CD8+T細胞在總T細胞中比例為0.288±0.116；CD4+T細胞計數占總T細胞0.429± 0.178。CD4+T細胞、CD8+T細胞以及CD4+/CD+8的比例在不同病理特征：腫瘤大小、有無包膜、有無癌栓之間無顯著性差異。

2.4 肝癌腫瘤浸潤細胞與預后的關系分析

癌旁組織CD8+T細胞浸潤對術后總生存無顯著性影響（P=0.579）。單因素分析癌巢內CD8+T細胞浸潤可以輕度降低患者復發，可降低患者約50%復發風險（OR=0.589，95%CI：0.353～0.982，P=0.042，表3）。對Kaplan-Meier分析有意義的因素進一步采用Cox模型回歸分析，結果顯示僅門靜脈癌栓（P＜0.001）是晚期肝癌患者預后的獨立因素。癌旁浸潤CD3+及CD8+T淋巴細胞均與預后無關，腫瘤內浸潤CD8+T數量與患者總生存期及術后5年復發率相關，但并不是預測患者遠期復發的獨立因子。

表1 147例肝癌患者的臨床病理特征Table 1 Clinicopathological features of 147 HCC patients

表2 影響HCC術后生存單因素及多因素分析Table 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis of variables associated with survival in HCC patients

圖1 肝癌癌組織內及癌周CD3+T細胞分布（IHC×100）Figure 1 Distribution of CD3+T cells in HCC tissue（IHC×100）

圖2 CD8+T細胞在癌巢之間的分布及比例Figure 2 Distribution and percentage of CD8+T cells between HCC nests

表3 影響HCC術后復發單因素及多因素分析Table 3 Univariate and multivariate Cox regression analysis of variables associated with recurrence in HCC patients

3 討論

肝癌是全世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率占癌癥死亡率第三位。由于不同的危險因子，地區性發病率差異較大，平均為5.5～14.9/10萬，在非洲亞撒哈拉和東南亞地區發病率高達100/10萬［1］。非洲及東南亞地區主要危險因子是HBV肝炎，而西方國家和日本則以HCV感染，其他因素如酒精性肝炎、黃曲霉素、原發性膽管硬化癥、糖尿病及遺傳因素均可作為危險因子［2］。

腫瘤發生過程中肝硬化、硬化結節轉變為癌前病變被廣泛證實及接受，80%～90%的肝癌患者有肝炎及肝硬化背景。這樣炎癥因素及免疫因素在肝癌發生進展中的作用應該得到重視［3］。肝癌組織浸潤調節性T細胞（Treg）數量和外周血Treg細胞比例增加，并且其數量與CD8+T細胞比例與肝癌轉移和預后相關［4-5］。雖然隨著腫瘤生長，腫瘤瘤內和癌周均可以出現淋巴浸潤細胞，但是這種矛盾的現象提示免疫控制的無效，浸潤的淋巴細胞并未出現理論上應有的作用，目前對癌周或腫瘤內出的淋巴細胞浸潤是正面還是負面作用仍舊存在爭論。

一般情況下，CD3+細胞代表成熟的T淋巴細胞，是細胞免疫中主要的活性細胞。根據其表面標記與功能的不同，CD3+T細胞可分為CD4+和CD8+T細胞二個亞群［6］。CD4+細胞主要指輔助性T細胞，能調節其它T細胞群的免疫應答、協助B細胞分泌抗體；CD8+細胞常表現細胞毒活性，是主要的細胞毒效應細胞。CD4+T/CD8+T比值保持動態平衡，以維持機體細胞免疫功能的穩定，當其比值降低，則患者細胞免疫功能低下，從而有利于腫瘤增殖［7］。在局部出現免疫抑制的狀態下而全身免疫并無缺陷，因此通過檢測患者外周血的免疫細胞分布來判斷宿主的免疫反應并不完全。本研究提示HCC組織局部CD4+T細胞數量和CD4+T/CD8+T比值的降低，可能造成了效應T淋巴細胞數量及功能異常，改變了組織局部免疫微環境，免疫抑制逐漸加重，免疫監視功能減弱，有利于腫瘤細胞增殖，從而有利于腫瘤的進展、侵襲或轉移。

本實驗中由于CD4+細胞免疫組化染色比例極低，而流式細胞儀檢測腫瘤患者外周血CD4+T細胞卻未見明顯減少，與CD8+T細胞比例為1.167，而肝臟局部的CD3+淋巴細胞浸潤明顯，其中以CD8+T細胞為主，提示腫瘤局部免疫仍以細胞免疫為主，局部缺乏輔助性T細胞可能是造成免疫逃逸的原因。

目前對Treg細胞的效應機制還不明確，實驗結果也存在矛盾［8-10］。有些實驗支持Treg細胞是通過與細胞接觸發揮抑制作用；另一些研究表明Treg通過分泌細胞因子（IL-10、TGF-β）而介導抑制效應。雖然近年來提出的Treg細胞增加可以減低殺傷細胞活性的觀點，由于在本實驗中CD4+Foxp3+細胞免疫組化出現比例極低，無法統計其與臨床病理特征的關系，目前的結果提示石蠟切片并非進行調節性T細胞的最佳選擇。本研究認為如能取新鮮組織分離單核淋巴細胞，流式細胞儀檢測敏感度可能提高。

由于T細胞及其亞群在外周血中比較穩定，T細胞亞群的數量和功能發生異常時都可導致機體免疫功能的紊亂，因此外周血T細胞亞群是可作為評價機體細胞免疫功能狀態的較好指標和參數［11-12］。

目前的研究認為單純通過肝癌癌周局部亞型細胞計數、特殊細胞群免疫組織化學染色等常規手段并不能準確得到相關預測信息，微環境分子水平的研究有待進一步明確。

[1] Wu HC,Wang Q,Yang HI,et al.Aflatoxin B1 exposure,hepati﹣tis B virus infection,and hepatocellular carcinoma in Taiwan[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2009,18(3):846-853.

[2] Chemin I,Zoulim F.Hepatitis B virus induced hepatocellular car﹣cinoma[J].Cancer Lett,2009,286(1):52-59.

[3] Yuen MF,Wong DK,Fung J,et al.HBsAg Seroclearance in chronic hepatitis B in Asian patients:replicative level and risk of hepatocellular carcinoma[J].Gastroenterology,2008,135(4):1192-1199.

[4]Unitt E,Rushbrook SM,Marshall A,et al.Compromised lympho﹣cytes infiltrate hepatocellular carcinoma:the role of T-regulatory cells[J].Hepatology,2005,41(4):722-730.

[5] Guo CL,Yang HC,Yang XH,et al.Associations between infil﹣trating lymphocyte subsets and hepatocellular carcinoma[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(11):5909-5913.

[6]Kobayashi N,Hiraoka N,Yamagami W,et al.FOXP3+regulato﹣ry T cells affect the development and progression of hepatocar﹣cinogenesis[J].Clin Cancer Res,2007,13(3):902-911.

[7] An JL,Ji QH,An JJ,et al.Clinicopathological analysis of CD8-positive lymphocytes in the tumor parenchyma and stroma of he﹣patocellular carcinoma[J].Oncol Lett,2014,8(5):2284-2290.

[8] Sasaki A,Tanaka F,Mimori K,et al.Prognostic value of tumorinfiltrating FOXP3+regulatory T cells in patients with hepatocel﹣lular carcinoma[J].Eur J Surg Oncol,2008,34(2):173-179.

[9] Unitt E,Marshall A,Gelson W,et al.Tumour lymphocytic infil﹣trate and recurrence of hepatocellular carcinoma following liver transplantation[J].J Hepatol,2006,45(2):246-253.

[10]Kalathil S,Lugade AA,Miller A,et al.Higher frequencies of GARP(+)CTLA-4(+)Foxp3(+)T regulatory cells and myeloidderived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients are associated with impaired T-cell functionality[J].Cancer Res, 2013,73(8):2435-2444.

[11]Zhang J,Dong B,Liang P,et al.Significance of changes in local immunity in patients with hepatocellular carcinoma after percuta﹣neous microwave coagulation therapy[J].Chin Med J(Engl), 2002,115(9):1367-1371.

[12]Koido S,Homma S,Hara E,et al.In vitro generation of cytotoxic and regulatory T cells by fusions of human dendritic cells and he﹣patocellular carcinoma cells[J].J Transl Med,2008,6:51.

（2015-03-13收稿）

（2015-05-02修回）

（編輯：周曉穎）

Phenotype and distribution of infiltrating lymphocytes in liver cancer tissues

Jiong SHI1,Qiongzhu DONG2,Lunxiu QIN2,3,Haijing SUN2,Huliang JIA3
1Department of Pathology,Nanjing Drum Tower Hospital,The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210008,China;2Institutes of Biomedical Sciences,Fudan University,Shanghai 200032,China;3Liver Cancer Institute and Zhongshan Hospital,Shanghai 200032,China.

Lunxiu QIN;E-mail:qin.lunxiu@zs-hospital.sh.cn

Objective:To identify the signature of tumor-infiltrating lymphocyte(TIL)subtypes that may affect cytokine expression between different outcomes of hepatocellular carcinoma(HCC)patients by analyzing the CD molecular expression profiles of noncancerous hepatic tissues.Methods:Surface markers of TIL in noncancerous hepatic tissues from 146 HCC patients were determined by using immunohistochemical method and flow cytometry.Univariate and multivariate Cox proportional hazards models and Kaplan-Meier method were used to analyze the association of their expression levels with tumor recurrence and survival.Results:More than 86.4%of TILs in patients were quiescent,as measured via CD4+or Foxp3 expression.Meanwhile,more than 90%of CD3+T cells expressed CD8+.The proportion of T cells was low compared with CD8+T cells.The proportion of CD19 and CD20 in distant nontumor tissues almost was zero.The proportion of T cell subgroups isolated from HCC circulating whole blood did not show a significant shift compared with the normal control,as follows:CD4+T/CD8+T=1.167±1.04,CD8+T/CD3+T=0.288±0.116,and CD4+T/CD3+T= 0.429±0.178.The proportion of CD8+T cells in noncancerous hepatic tissues was higher than that in blood(P＜0.001).Conclusion: TILs in HCC noncancerous hepatic tissues are increased and contain a subpopulation of CD3+CD8+T cells.CD8+T cells in cancerous tissues,rather than noncancerous tissues,show significant differences between different prognostic groups.

tumor-infiltrating lymphocyte,hepatocellular carcinoma,phenotype,prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.20150297

①南京大學附屬鼓樓醫院病理科（南京市210008）；②復旦大學生物醫學研究院；③復旦大學附屬中山醫院肝外科

欽倫秀 qin.lunxiu@zs-hospital.sh.cn

史炯 專業方向為肝癌病理診斷及侵襲、轉移的機制研究。

E-mail：shijiong301@sina.com