利用簡并引物檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因

劉繼超 陳柏儒 姜鐵民 陳歷?。?北京三元食品股份有限公司，北京 0063；.北京市育才學校，北京 00050）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA），是目前最常見的能夠引起細菌性食物中毒的病原體之一，該菌產生葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）是引起食物中毒的主要原因。根據血清學特性，SEs可分為5型（SEA、SEB、SEC、SED、SEE），這五類稱為經典腸毒素，也是全球食物中毒中最常見的血清型［1，2］，其中引起的食物中毒最多的是A和D型，B和C型次之。

目前檢測金黃色葡萄球菌腸毒素的主要方法是免疫學方法，其特異性和靈敏度較差，已不能滿足食物中毒等公共安全事件檢測的需要［3］。但隨著PCR技術的完善，應用該技術檢測金黃色葡萄球菌腸毒素的報道［4－6］越來越多。顧琳等［7］使用PCR技術檢測出食品中金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、G等，其中SEA的檢出率最高為77.27%。Mehrotra等［8］使用多重PCR技術檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C、D、E的基因，比用單一引物更具特異性和有效性。而簡并引物有比特異引物有更高的適應性［9］，以及較寬的檢測范圍，這對提高檢測效率和降低檢測成本更為有利。本研究擬利用SEA與SEB之間具有同源性的特點，自行設計簡并引物SEAB，在同一臺PCR儀、同一PCR條件下，建立同時檢測SEA、SEB的方法，不僅能夠克服酶聯免疫法檢測時間長的問題，還可提高PCR技術的檢測效率，降低檢測成本，對于快速診斷是否是由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

PCR儀：GeneAmp PCR System 2400型，美國PE公司；

電泳儀：PAC300型，伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；

天能凝膠成像儀：Tanon GIS 2010型，上海天能科技有限公司；

離心機：2K15型，美國Sigma公司。

1.1.2 試劑

乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、無水乙醇、苯酚、三氯甲烷、異戊醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

胞壁質酶：超純，10kU/mg，美國Sigma公司；

核糖核酸酶A：≥50kU/mg，美國Sigma公司；

瓊脂糖：優級純，Spain Agarose香港基因公司；

dNTPs、PCR染料、DNA Marker B：超純，北京賽百盛基因技術公司；

Taq DNA聚合酶：5U/μL，北京賽百盛基因技術公司；

PCR產物回收試劑盒（離心柱型）、新型pUM－T快速克隆試劑盒：北京百泰克生物技術有限公司。

1.1.3 菌種

金黃色葡萄球菌腸毒素SEA（ATCC－13565）、金黃色葡萄球菌腸毒素SEB（ATCC－14458）：中國藥品生物制品檢定所菌種保藏中心；

金黃色葡萄球菌（CGMCC1.0128）、大腸桿菌（CGMCC1.1369）、沙門氏菌（CGMCC1.1552）、表皮葡萄球菌（CGMCC1.2429）：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板提取 挑取金黃色葡萄球菌腸毒素SEA和SEB的菌落，分別接種于10mL營養肉湯中，放置與37℃生化培養箱內培養12h后，培養基中有大量菌體增殖，分別離心收集菌體，提取基因組 DNA［3，10］，于－20℃保存備用。

1.2.2 擴增引物設計 依據http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/上發布的SEA和SEB的基因編碼序列，利用生物軟件ClustalW與Primer 5.0，設計檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A和B的簡并引物SEAB（見表1），簡并引物SEAB在SEA和SEB上的相應位置分別為566～670，338～472，擴增產物長度分別為105，135bp。

表1 引物SEAB的序列Table 1Primers sequence of SEAB

1.2.3 配制PCR反應體系 PCR技術檢測金黃色葡萄球菌腸毒素SEA和SEB的反應體系為20μL：模板1μL、上下游引物各0.5μL（25μmol/L）、10×擴增反應緩沖液2μL、PCR染料2μL、dNTPs 0.5μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，其余為無菌超純水。離心混勻后置PCR儀上進行擴增反應，循環參數設置：預變性95℃3min，變性95℃30s→退火51℃30s→延伸72℃1min，循環數為30，最后72℃延伸10min。從上述反應體系中吸取10μL，用于電泳檢測。

1.2.4 克隆及測序 吸取PCR擴增后反應體系100μL，按PCR產物回收試劑盒的說明書操作。菌液抽提陽性質粒，送至天根科技公司進行測序。

1.2.5 特異性分析 利用上述PCR檢測方法同時擴增SEA菌株、SEB菌株和對照菌株的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、表皮葡萄球菌基因組DNA，然后電泳檢測PCR擴增產物，判定簡并引物的特異性。

1.2.6 靈敏度分析 將提取的模板DNA進行適量稀釋，再使用紫外分光光度計測定260nm波長下的OD值，按式（1）計算其濃度。然后將其按照10倍系列進行逐步稀釋至10－5，以此為模板進行PCR檢測，以分析簡并引物SEAB檢測SEB的DNA靈敏度。

式中：

c——DNA濃度，μg/mL；

m——50μg/mL，OD260＝1 時 dsDNA 濃 度 約 為50μg/mL；

n——模板稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 測序結果

將測序的結果在NCBI的Blast上與GenBank中核苷酸序列進行比對分析，結果發現與GenBank上發布的SEA和SEB基因序列的同源性均達到99%（見圖1、2），證明了擴增的目的產物分別為SEA、SEB基因。

圖1 SEA的Blast比對結果Figure 1 Blast comparison results of SEA

圖2 SEB的Blast比對結果Figure 2 Blast comparison results of SEB

2.2 簡并引物SEAB特異性分析

在同一個反應體系中分別加入SEA、SEB菌的DNA模板1μL，無菌超純水12μL，其余用量與反應條件均同1.2.3，電泳檢測的結果見圖3、4。由圖3、4可知，PCR反應分別擴增出SEA和SEB菌的目的基因片段，而對照組未出現特異性片段，顯示出良好的特異性，且整個檢測過程不超過20h，說明簡并引物SEAB可以在同一個反應體系與反應條件下同步檢測產SEA和SEB的金黃色葡萄球菌。

圖3 SEA、SEB在同一個PCR反應管中反應的電泳分析圖Figure 3 Electrophoretic analysis of SEA and SEB in the same PCR reaction tube

圖4 簡并引物SEAB特異性的瓊脂糖凝膠電泳分析圖Figure 4 Electrophoretic analysis the specificity of SEAB with degenerate primers

2.3 簡并引物SEAB靈敏性分析

紫外分光光度計分別測定SEB的DNA模板的OD260＝0.716 0，得出DNA含量為358ng/μL，分別吸取各稀釋倍數的DNA模板1μL，進行PCR檢測，結果見圖5。由圖5可知，DNA靈敏度為3.58ng。

圖5 簡并引物SEAB靈敏性的瓊脂糖凝膠電泳分析圖Figure 5 Electrophoretic analysis the sensitivity of SEAB with degenerate primers

3 結論

本研究通過對SEA、SEB設計簡并引物SEAB建立了能夠準確地擴增目的基因的PCR方法，即一次PCR反應可同時擴增兩個靶基因，表現出了良好的特異性，能夠有效區分其它引起食物中毒的病原菌，SEB的DNA最低檢測濃度為3.58ng，整個檢測過程不超過20h，不但節省了檢測時間，降低了檢測成本，減少了漏檢的可能性，而且為金黃色葡萄球菌腸毒素SEA和SEB菌引起的食物中毒事件快速篩查，以及流行病學研究提供了一種快速準確的檢測方法。

在PCR反應中，若簡并引物的簡并度過高，PCR擴增產物的擴增效率和特異性較差，會嚴重影響目的片段的分離，應適當增加引物的濃度和調整退火溫度，才能獲得理想的檢測效果［11］。而本研究設計的簡并引物的簡并度較低為32，不增加引物濃度或降低退火溫度同樣可獲得較好的擴增結果。此外也應注意，在設計簡并引物時，由于簡并度的增加，PCR的特異性會下降，可能會造成假陽性結果。因此，探討如何降低簡并引物的簡并度，提高簡并引物的PCR擴增效率和特異性對于成功應用簡并引物PCR法具有重要意義，例如用脫氧次黃苷（dI）替代簡并引物中的高簡并位點，可大幅度降低簡并程度，顯著提高擴增產物的特異性及擴增效率。

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3 劉繼超，姜鐵民，姜阿赤.多重PCR檢測金黃色葡萄球菌六型腸毒素基因的研究［J］.食品科技，2012，37（6）：304～307.

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7 顧琳，黃平，宋衍燕，等.PCR檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素基因［J］.中國食物與營養，2015，21（2）：17～19.

8 Mehrotra M，Wang G，Johnson W M.Multiplex PCR for detection of genes for Staphylococcus aureusenterotoxins，exfoliative toxins，toxic shock syndrome toxin 1，and methicllin resistance［J］.Journal of Clinical Microbiology，2000，38（3）：1 032～1 035.

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10 Moon J S，Lee A R，Kang H M，et al.Antibiogram and coagulase diversity in staphylococcal enterotoxin－producingStaphylococcus aureusfrom bovine mastitis［J］.Journal of Dairy Science，2007，90（4）：1 716～1 724.

11 Simon A L，Jean M D，Johan M，et al.Identification of potyviruses using the polymerase chain reaction with degenerate primers［J］.Journal of General Virology，1991（73）：1 531～1 541.