靈芝子實體多糖的分離純化、組成及其免疫活性研究

楊 慧 戴 軍 陳尚衛 朱 松

（江南大學食品與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

國內外的研究［1］表明，靈芝的藥理活性歸因于其中含有的多糖、三萜、腺苷、生物堿、甾醇和有機鍺等，而靈芝多糖（GanodermaLucidumpolysaccharides，GLP）是其主要功能性成分之一，具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等重要的藥理活性［2－7］。其活性與多糖的組成和結構密切相關［8］。

目前，越來越多的學者［9－11］將靈芝多糖進行分離純化后，進一步研究它們的結構、組成及活性特征，從而對靈芝多糖的活性作用機制或具體的結構組成對活性的影響獲得更深入的了解，但很少有學者從一種靈芝子實體多糖中分離出兩種分子量在400萬以上的靈芝多糖組分并對其進行比較。本試驗為考察和探明江西某企業自主研發的新菌株培育的赤芝子實體的多糖組成特性及其免疫活性，對其多糖進行分離純化后，分別利用高效體積排阻色譜（HPSEC）、PMP柱前衍生化反相高效液相色譜（RP—HPLC）及紅外光譜（FT—IR）和光散射（SEC—LLS）等技術分析研究了該多糖不同純化級分的單糖組成、分子量分布、異頭碳連接方式、鏈構象特性及其免疫活性，為該靈芝品種的進一步優化及其產品研發提供了基礎性科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀：Waters 1525型，安捷倫科技有限公司；

示差折光檢測器：2414型，美國 Waters Corporation公司；

高速冷凍離心機：Beckman J-26xp型，美國 Beckman Coulter Inc公司；

冷凍干燥機：SCIENTZ-10N型，寧波新芝生物股份有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9053A型，上海滬西分析儀器廠。

1.1.2 試劑及樣品

1－苯基-3-甲基-5-吡唑琳酮（PMP）：99%，美國Acros Organics公司；

乙腈：HPLC級，美國Tedia公司；

三氟乙酸（TFA）：＞99%，國藥集團化學試劑有限公司；

胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；

DMEM培養液：美國GIBCO生命技術公司；

MTT：美國Biosharp公司；

二甲亞砜（DMSO）：分析純，無錫市展望化工試劑有限公司；

C57雄性小鼠：體重為（25±3）g，蘇州愛爾麥科技有限公司；

靈芝子實體：由江西某企業提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 靈芝多糖的提取與分離純化

（1）靈芝多糖的提取：將兩種不同的靈芝子實體樣品置于35℃真空干燥箱中烘干，切片粉碎。準確稱量一定量的靈芝子實體，按料液比1∶20（m∶V）加入純水于100℃下水浴回流提取6h，水提液濃縮后加入3倍體積的95%的乙醇醇沉，4℃下靜置過夜，離心（4 000r/min，20min）得到的沉淀再分別用95%乙醇、無水乙醇洗滌過濾后于40℃真空干燥后即得靈芝粗多糖備用。

（2）靈芝多糖脫色及脫蛋白：將上述靈芝粗多糖配成約5mg/mL的多糖水溶液50mL，加入 AB-8樹脂2.5g，在pH為3.0，溫度為50℃的水浴振蕩條件下脫色6h［12］，脫色之后的多糖溶液置于離心管中按5∶1（V∶V）加入Sevag試劑（V氯仿∶V正丁醇＝4∶1的混合液），置于離心管中，振蕩30 min后，靜置分層將白色絮狀物和氯仿相去除，重復此過程直到白色絮狀物不再出現為止。

（3）靈芝多糖的分離純化：將1.2.1（2）處理后的靈芝多糖通過DEAE-Sepharose Fast Flow柱（3.2cm×25cm）進行分離。用自動收集器分別收集洗脫液200管，前100管以pH 7.8 0.02NTris—HCl溶液為洗脫液，后100管以0.01～1.00MNaCl＋0.02MTris—HCl溶液梯度洗脫，流速為8mL/min，每分鐘收集1管。以苯酚硫酸法［13］跟蹤檢測各個管的多糖含量，每5管取1mL繪制多糖洗脫曲線并分步收集各多糖組分，獲得的級分用截留分子量為30萬的透析袋蒸餾水中透析48h去除30萬以下的組分以及鹽離子，減壓旋蒸濃縮（－0.1MPa）后凍干備用。

1.2.2 HPSEC分析

（1） 色 譜 條 件：色 譜 柱：Shodex OHpak SB-803 和805HQ 8.0mmID×300mmL兩根根柱串聯；檢測器：示差折光檢測器；流動相：0.1MNaNO3；流速：0.8mL/min；柱溫：30℃；進樣體積：20μL。

（2）樣品相對分子量分布：將不同分子量的葡聚糖標準品配制成約為3mg/mL的溶液進樣分析。根據每個標樣的保留時間和對應分子量由GPC軟件做出分子量校正曲線，同樣條件下將多糖樣品進樣分析，根據樣品峰數據由GPC軟件計算出多糖樣品相對分子量及其分布。

1.2.3 多糖樣品完全酸水解 將得到的多糖各個級分別配成濃度約為5mg/mL的水溶液。吸取500μL溶液于具塞試管中，加入500μL 2MTFA溶液，充分混勻后充入N2封管，置于110℃烘箱中水解120min，取出冷卻至室溫，加入同體積的甲醇，氮氣吹干，重復3～4后以1mL超純水溶解［14］。

1.2.4 混合單糖標樣及靈芝多糖樣品的PMP衍生化 取100μL的混合單糖標準液（各單糖質量濃度均為3mg/mL左右）與等體積0.6MNaOH溶液混合均勻，取50μL上述混合液于5mL具塞試管中，加入50μL 0.5M的PMP甲醇溶液，旋渦混勻；70℃下反應100min中，取出冷卻至室溫，加60μL 0.3M的HCl溶液中和，再加水補至1mL后混勻，然后加入等體積的氯仿，劇烈振搖，待靜置分層后，棄去下層有機相，如此重復3次，得到的上層水相過0.45μm微孔濾膜，進樣分析［14］。

靈芝多糖樣品水解產物的PMP衍生化方法與混標衍生化方法相同。取1.2.3所得的多糖水解液100μL，按1.2.4方法同樣進行PMP衍生化處理，過微孔濾膜后供進樣分析。

1.2.5 傅立葉紅外（FT—IR）光譜分析 取各組分凍干樣品3mg左右放入研缽中，加適量溴化鉀充分研磨后壓片，4 000～400cm－1區間掃描，掃描32次，分辨率為4cm－1。

1.2.6 體積排阻色譜和光散射儀聯用 采用體積排阻色譜和光散射儀聯用裝置（SEC—LLS）測試試樣的重均分子量（Mw）、均方根旋轉半徑（S2＞Z1/2或者稱為 RMS）及多分散系數（Mw/Mn）。激光光散射儀為美國 Wyatt技術公司DAWN DSP多角度激光光散射儀（MALLS，DAWN DSP，Wyatt Technology Co.，Santa Barbara，CA，USA），波長為633nm。體積排阻色譜裝置分別使用水體系的Shodex OHpak SB-805HQ和Shodex OHpak SB-804HQ 色譜柱串聯和泵（Thermo Separation Products，San Jose，CA，USA）及示差折光檢測器（RI-150，Thermo Finnigan，USA）。試驗過程中以0.2M的NaCl水溶液及2×10－5M的疊氮化鈉作為流動相。多糖分別溶于0.2M的NaCl水溶液中，配制濃度為1mg/mL。進樣前樣品及流動相需經過0.2μm濾膜過濾。測試溫度25℃，進樣量200μL，流速0.5mL/min。

1.2.7 靈芝多糖促進正常小鼠脾淋巴細胞增殖試驗 參照文獻［15］進行。

2 結果與討論

2.1 靈芝多糖的分離分級及其純化產品的組成

以DEAE-Sepharose Fast Flow對脫色脫蛋白之后的靈芝多糖進行分離，用自動收集器收集洗脫液，控制流速8 mL/min，苯酚—硫酸法跟蹤檢測洗脫液的濃度，并以管數為橫坐標，吸光值A490為縱坐標繪制洗脫曲線，得到的洗脫曲線見圖1。將洗脫曲線中不同的多糖級分分別收集、濃縮、透析后凍干即得到2個多糖級分，分別為GLPD1，GLPD2。GLPD1和GLPD2的化學組成見表1。

圖1 靈芝多糖過DEAE Sepharose Fast Flow洗脫曲線Figure 1 Elution profile of the crude polysaccharide sample by ion exchange chromatography on DEAE Sepharose Fast Flow

表1 GLPD1、GLPD2的化學組成Table 1 Primary components of GLPD1，GLPD2%

2.2 HPSEC測定的相對分子量

將GLPD1與GLPD2配制成濃度約為3～5mg/mL的多糖溶液，進行HPSEC分析。其結果（圖2）表明兩種多糖級分的純度較高，均可以達到85%以上，且重均分子量分別為440，427萬左右（圖中所示為質均分子量）。

2.3 靈芝多糖的單糖組成分析

按1.2.3和1.2.4方法測得靈芝子實體多糖GLPD1與GLPD2的單糖組成見表2，圖3為12種單糖混標的PMP衍生物的HPLC圖譜。由表2可知，兩種靈芝多糖級分的單糖的種類及各單糖的比例有較大差異。

2.4 靈芝多糖級分紅外光譜分析

為了分析純化的靈芝多糖級分的功能基團，使用傅立葉紅外光譜儀檢測了靈芝多糖級分在4 000～400cm－1的紅外吸收，結果見圖4。紅外光譜圖顯示：2種靈芝多糖組分的特征峰主要出現在3 380，2 924，l 650，1 378，1 060，894cm－1處，這些都明顯是多糖的特征吸收峰。其中3 380cm－1左右出現的寬峰是由O—H的伸縮振動所引起，2 924cm－1左右出現的較弱的峰是由于C—H的伸縮振動，而1 650cm－1處出現的較強的峰由C═O伸縮振動引起，1 375cm－1附近出現的峰是由于C—H的變角振動，1 058～1 072cm－1附近出現的較寬的峰是常見的C—O—C和—OH特征共振吸收峰。在894cm－1左右較小的吸收峰是典型的吡喃葡聚糖和β－型糖苷鍵連接特征吸收峰。該結果表明兩個靈芝多糖級分的異頭碳均為β構型［16］。

圖2 GLPD1與GLPD2的GPC分析圖譜Figure 2 GPC elution profile of GLPD1and GLPD2

圖3 12種單糖PMP衍生物的HPLC圖譜Figure 3 Chromatograms of PMP derivatives of twelve kinds of monosaccharides by HPLC

2.5 SEC—LLS測定靈芝多糖組分分子量及鏈構象

體積排除色譜和光散射儀聯用技術（SEC—LLS）是一種測試高聚物絕對分子量Mw、〈S2〉＞Z1/2以及Mw/Mn的有力工具［17］。通過SEC—LLS聯用技術檢測到的SEC譜圖是由無數個試驗點組成的，可以看成是由無數個單分散的級分組成。因此，可以利用這些級分點建立Mw和〈S2〉＞Z1/2二者之間的關系式，即〈S2〉＞Z1/2＝f（Mw）［18］。由SEC—LLS測得的GLPD1和GLPD2分子量及激光光散射信息見圖5。GLPD1及GLPD2的分子量及其鏈構象參數見表3。

由圖5可知，兩種多糖級分純度均較高；GLPD1與GLPD2由SEC—LLS測得的結果均比2.2中測得的結果要高，這主要歸因于HPSEC（示差折光檢測）測定的結果一般均為相對分子質量，而非絕對分子量（由于該法制作分子量校正曲線所用標準品的多糖組成結構與實際樣品有一定差異，且本試驗標準品最大分子量為200萬，大于200萬的分子量結果是由分子量校正曲線外推所得）。表3中的α值與高分子的構象有直接聯系，通常情況下，α值為0.2～0.4時，高分子為高支化的緊縮鏈構象，α值等于0.3時其接近球形鏈構象；0.5～0.6時，高分子為柔性鏈；0.6～1.0時，高分子為半剛性鏈［18］。而α的計算是由Mw和〈S2〉＞Z1/2的依賴關系獲得，通過SEC—LLS的譜圖上的大量數據點可以得到高聚物在稀溶液中的函數方程〈S2〉＞Z1/2＝kMwα，根據圖6中的截距與斜率可以求出α值。

由表3可知，GLPD1與GLPD2的α值分別為0.15，0.19，接近0.2，此外，圖6表現出明顯的 U型［17］，這說明靈芝多糖級分在0.2MNaCl中為高支化的緊縮結構。

表2 靈芝子實體多糖的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of GLPD1and GLPD2 /mol%

圖4 GLPD1與GLPD2的紅外光譜圖Figure 4 FT—IR spectrum of the polysaccharide fraction GLPD1and GLPD2

2.6 靈芝多糖體外對正常小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響

靈芝多糖對正常小鼠脾淋巴細胞增殖作用體外試驗結果（見圖7）表明，GLPD1與GLPD2兩個多糖級分均對小鼠脾淋巴細胞增殖有一定的促進作用，且GLPD2對促脾淋巴增殖具有明顯的量效關系，在濃度達到500μg/mL時促進作用最強。而GLPD1促進脾淋巴細胞增殖活性明顯低于GLPD2，且其活性與濃度之間無明顯的量效關系。

圖5 GLPD1和GLPD2的SEC—LLS檢測圖譜Figure 5 The SEC—LLS spectra of GLPD1and GLPD2

表3 GLPD1及GLPD2分子量及構象參數Table 3 Molecular weight and conformation parameter of GLPD1and GLPD2

3 結論

從一種新菌株培育的赤芝子實體中提取分離靈芝多糖，最終得到兩種分子量較大（相對分子量均可達400萬Da以上）且單糖組成不同的水溶性靈芝多糖組分GLPD1與GLPD2；SEC—LLS、PMP柱前衍生化反相色譜和傅立葉紅外光譜分析結果顯示兩者均為高支化的β－雜多糖。體外促進正常小鼠脾淋巴細胞增殖活性試驗結果表明，兩個多糖級分均具有一定的免疫活性，GLPD2的免疫活性均比GLPD1高，且GLPD2促進正常小鼠脾淋巴細胞增殖活性具有量效相關性。

圖6 GLPD1和GLPD2的RMS構象圖Figure 6 Dependence of RMS on Mw for GLPD1and GLPD2

圖7 GLPD1與GLPD2促進脾淋巴細胞增率Figure 7 Effect of GLPD1and GLPD2on the proliferation of splenocytes

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