復(fù)合蛋白酶水解玉米谷蛋白產(chǎn)物的抗氧化活性研究

劉 玥 劉曉蘭 鄭喜群 周利敏

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

在玉米濕法淀粉加工過程中，可從淀粉乳中分離出5%～6%的玉米蛋白粉，玉米蛋白粉含蛋白質(zhì)60%以上，玉米谷蛋白占其總蛋白含量的22%。玉米谷蛋白含大量酰胺基氨基酸，其中谷氨酰胺占總氨基酸的1/3［1］。谷氨酰胺是細(xì)胞增殖的主要能源，是增強(qiáng)腸免疫的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；又是合成體內(nèi)極其重要的抗氧化劑—還原型谷胱甘肽的前體物質(zhì)［2］。玉米谷蛋白由于富含二硫鍵而不溶于水，可溶于稀酸或稀堿溶液［3］，此特點(diǎn)限制了其功能性質(zhì)的發(fā)揮和應(yīng)用。

生物體中活性自由基的積累會(huì)產(chǎn)生諸多破壞作用，如損傷細(xì)胞膜、使血清蛋白酶失去活性、損傷基因?qū)е录?xì)胞變異、對(duì)機(jī)體造成衰老或引發(fā)其他疾病［4］。在食品加工及貯藏中，自由基會(huì)引起食品發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而引起食品的變質(zhì)。人工抗氧化劑可能存在潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)，因此需迫切開發(fā)天然抗氧化劑。Suetsuna K、Pena-Ramos EA、王俊彤等［5－7］已分別在酪蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白中發(fā)現(xiàn)了許多抗氧化活性肽。目前未見復(fù)合蛋白酶（protamex）水解玉米谷蛋白酶解物抗氧化活性研究的相關(guān)報(bào)道。本研究擬采用Protamex水解玉米谷蛋白，探索水解時(shí)間對(duì)蛋白酶解物抗氧化活性的影響，以期為玉米谷蛋白在功能食品中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

玉米蛋白粉：黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司；

Protamex復(fù)合蛋白酶：4.32×104U/g，諾維信公司；

其他試劑：分析純；

pH計(jì)：PB-10型，北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司；

雙光束紫外可見分光光度計(jì)：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

可見分光光度計(jì)：722s型，上海欣茂儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米谷蛋白酶解物的制備 將玉米谷蛋白按底物濃度5% （m/V）加入到磷酸鹽緩沖液（pH 7.0，50mmol/L）中，50℃下按酶與底物之比為0.81∶100（m∶m）加入復(fù)合蛋白酶Protamex，向反應(yīng)體系中滴加0.2mol/L NaOH溶液維持pH 恒定，控制水解時(shí)間分別為15，30，60，90，120，150 min。酶解反應(yīng)后于沸水中滅酶30min，10 000r/min離心15min得酶解液，酶解液冷凍干燥待用。

1.2.2 玉米谷蛋白酶解物的水解度測(cè)定 采用pH-stat法［8］。

1.2.3 玉米谷蛋白酶解物分子量分布測(cè)定 凝膠柱Superdex Peptide 10/300GL安裝于purifier100蛋白質(zhì)色譜儀上，上樣量100μL，流速0.25mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，流動(dòng)相為 含 0.15mol/L NaCl的 磷 酸 鹽 緩 沖 液 （pH 7.0，0.02mol/L），上樣前標(biāo)準(zhǔn)蛋白于10 000r/min離心10min，并用0.22μm微孔濾膜過濾。測(cè)定藍(lán)色葡聚糖2000和各分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Aprotinine、桿菌肽、氧化型谷光甘肽、還原型谷光甘肽）的洗脫體積（Ve）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的凝膠過濾洗脫曲線，做標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量對(duì)數(shù)（lgMr）與可用分配系數(shù)（Kaw）關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中Kaw＝（Ve－V0）/（Vt－V0）。由于藍(lán)色葡聚糖2000在Superdex Peptide 10/300GL色譜柱上被完全排阻，其洗脫體積Ve相當(dāng)于色譜柱外水體積V0，柱床總體積Vt為24mL。根據(jù)各分子量標(biāo)準(zhǔn)的洗脫體積，計(jì)算相應(yīng)Kaw，做標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量對(duì)數(shù)（lgMr）與可用分配系數(shù)（Kaw）關(guān)系的回歸方程。

玉米谷蛋白酶解物（2mg/mL）用流動(dòng)相溶解，10 000r/min離心10min，取上清液過0.22μm微孔濾膜，上樣量100μL，流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，流速0.25mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。根據(jù)玉米谷蛋白酶解物凝膠過濾洗脫體積，計(jì)算相應(yīng)Kaw，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量對(duì)數(shù)（lgMr）與可用分配系數(shù)（Kaw）關(guān)系的回歸方程，計(jì)算玉米谷蛋白酶解物的分子量。

1.2.4 玉米谷蛋白酶解物抗氧化活性測(cè)定

（1）清除DPPH自由基活性的測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)［9］，修改如下：取2mL玉米谷蛋白酶解液（2mg/mL），加入2mL DPPH無水乙醇溶液（0.1mmol/L），混合均勻，避光反應(yīng)30 min，在517nm處測(cè)其吸光值（Ai）；取2mL玉米谷蛋白酶解液于試管中，加入2mL無水乙醇，在517nm處測(cè)其吸光值（Aj）；取2mL DPPH 無水乙醇溶液（0.1mmol/L）和2mL無水乙醇反應(yīng)作為參比，在517nm處測(cè)其吸光值（A0）。0.01mg/mL的VC溶液作為對(duì)照。樣品對(duì)DPPH自由基的清除率K按式（1）計(jì)算：

式中：

K——對(duì)DPPH自由基的清除率，%；

A0——2mL DPPH 無水乙醇溶液（0.1mmol/L）與2 mL無水乙醇在517nm下的吸光值；

Ai——2mL DPPH 無水乙醇溶液（0.1mmol/L）與2 mL樣品溶液反應(yīng)在517nm下的吸光值；

Aj——2mL無水乙醇與2mL樣品溶液在517nm下的吸光值。

（2）清除羥基自由基（·OH）活性的測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)［10］，修改如下：取2mL玉米谷蛋白酶解液（2mg/mL），依次加入2mL FeSO4（6mmol/L）、H2O2（6mmol/L），混勻后靜置10min，再加入2mL水楊酸 （6mmol/L），混勻，靜置30min，在510nm處測(cè)定吸光值（Ai＇）。用去離子水代替水楊酸重復(fù)以上操作測(cè)定510nm處的吸光值（Aj＇），用去離子水代替樣品重復(fù)以上操作測(cè)定510nm處的吸光值（A0＇）。0.01mg/mL的VC溶液作為對(duì)照。樣品對(duì)羥基自由基的清除率Y按式（2）計(jì)算：

式中：

Y——對(duì)羥基自由基的清除率，%；

Ai＇——樣品溶液在510nm處的吸光值；

A0＇——去離子水代替樣品在510nm處的吸光值；

Aj＇——去離子水代替水楊酸在510nm處的吸光值。

式中：

I——對(duì)超氧陰離子自由基的抑制率，%；

V空白——空白組鄰苯三酚自氧化速率，A/min；

V樣品——樣品組鄰苯三酚自氧化速率，A/min。

（4）還原力測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)［12］，修改如下：取2mL玉米谷蛋白酶解液（2mg/mL），分別加入2mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.6，0.2mol/L），2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）溶液，混勻，在50℃水浴下保溫20min，再加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸（TCA）溶液，震蕩搖勻后以4 000r/min離心10min。取離心后上清液2mL，加入2mL去離子水和0.4mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3溶液，震蕩搖勻后在50℃水浴下保溫10min，在700nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的吸光值。以去離子水代替樣品重復(fù)以上操作作為空白，0.01 mg/mL的VC溶液作為對(duì)照。

（5）與亞鐵離子螯合能力的測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)［13］，修改如下：取1mL玉米谷蛋白酶解（2mg/mL）液加入2mL FeCl2（20μmol/L），混 勻 后 加 入 2mL 菲 洛 嗪 溶 液 （0.5mmol/L），劇烈震蕩搖勻，室溫下靜置10min，在563nm處測(cè)定吸光值（A樣品），以去離子水代替玉米谷蛋白酶解液作為空白（A空白）。0.01mg/mL的 VC溶液作為對(duì)照。樣品與亞鐵離子的螯合率按式（4）計(jì)算：

式中：

Y——與亞鐵離子的螯合率，%；

A樣品——樣品溶液參加以上反應(yīng)測(cè)定563nm處的吸光值；

A空白——去離子水參加以上反應(yīng)測(cè)定563nm處的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)中數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定的平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用IBM SPSS Statistics 19軟件中的單因素方差分析（One-way AVONA）和Duncan多重比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異顯著，用Excel 2003軟件繪制圖示。

2 結(jié)果和討論

2.1 水解時(shí)間的影響

由表1可知，Protamex水解玉米谷蛋白反應(yīng)時(shí)間在15～150min內(nèi)，水解度變化緩慢，但酶解物的分子量分布變化較大。水解時(shí)間為15min時(shí)，酶解物中分子量大于6 511Da的蛋白組分占82.39%；水解時(shí)間為120min時(shí)，酶解物中分子量6 511.51～307.32Da的組分占94.36%。即隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，大分子量蛋白含量逐漸降低，小分子量蛋白含量逐漸增加。

表1 Protamex酶解玉米谷蛋白水解時(shí)間與其水解度和分子量分布關(guān)系Table 1 Hydrolysis degree and molecular weight distribution of corn glutelin hydrolysate by Protamex during hydrolysis process

2.2 清除DPPH自由基的活性

由圖1可知，Protamex酶解玉米谷蛋白時(shí)，不同水解時(shí)間的酶解物對(duì)DPPH自由基都具有清除作用，但清除能力有差異，顯著性分析結(jié)果表明水解時(shí)間在15～90min范圍內(nèi)的差異不大。水解時(shí)間為120min時(shí)，酶解物對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到最大值，為（58.86±1.40）%，該值與0.01mg/mL的Vc溶液對(duì)DPPH自由基的清除率相當(dāng)，且顯著性分析結(jié)果表明該值與Vc溶液對(duì)DPPH自由基的清除率之間無顯著性差異。這個(gè)結(jié)果表明，玉米谷蛋白酶解物中大分子量和小分子量肽段均具有對(duì)DPPH自由基的清除活性，水解時(shí)間為120min時(shí)，酶解物中的大分子量和小分子量的肽段均達(dá)到對(duì)DPPH自由基清除率的最大值，酶解過程中可能產(chǎn)生具有供氫能力的氨基酸如色氨酸和酪氨酸。在水解時(shí)間為150min時(shí)，酶解物對(duì)DPPH的清除率反而降低，可能原因是酶解產(chǎn)物由于過度水解，大分子量的肽段繼續(xù)水解成小分子的肽段，從而使對(duì)DPPH自由基具有清除能力的肽段被破壞，具有活性的氨基酸含量降低。酶解物的分子量和水解時(shí)間與對(duì)DPPH自由基的清除率高低不具有相關(guān)性［14］，過度水解其對(duì)DPPH自由基清除能力反而下降。

圖1 Protamex酶解玉米谷蛋白水解時(shí)間與酶解物對(duì)DPPH自由基清除率的關(guān)系Figure 1 Relation between hydrolysis time and DPPH radical scavenging activities of corn glutelin hydrolysate by Protamex

2.3 清除羥基自由基的活性

圖2 Protamex酶解玉米谷蛋白水解時(shí)間與酶解物清除羥基自由基活性的關(guān)系Figure 2 Relation between hydrolysis time and hydroxyl radical scavenging activities of corn glutelin hydrolysate by Protamex

由圖2可知，Protamex酶解玉米谷蛋白時(shí)，不同水解時(shí)間的酶解物對(duì)羥基自由基都有很強(qiáng)的清除率。水解時(shí)間為15min時(shí)，酶解物已經(jīng)顯示出對(duì)羥基自由基的清除能力，此時(shí)清除率達(dá)到（82.89±1.53）%；水解時(shí)間在30～60min內(nèi)酶解物對(duì)羥基自由基清除率變化不大，水解時(shí)間為120min時(shí)，酶解物對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到（82.64±0.75）%，而作為對(duì)照的Vc溶液對(duì)羥基的清除率為（34.09±1.33）%。結(jié)果表明，低濃度的酶解物在水解反應(yīng)初期（水解時(shí)間為15 min時(shí)）具有很好的對(duì)羥基自由基的清除效果，可能原因是酶解反應(yīng)過程中，玉米谷蛋白致密的結(jié)構(gòu)被破壞，具有抗氧化活性的基團(tuán)部分暴露出來，其中分子量大于6 511.51Da的肽段清除羥基自由基活性為主要作用，該水解度下生成具有清除羥基自由基的重要肽段。隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，水解時(shí)間在90和120min時(shí)，分子量在6 511.51～307.32Da的肽段清除羥基自由基活性為主要作用。水解時(shí)間為150min時(shí)，分子量在6 511.51～307.32Da的肽段被水解成更小的肽段，破壞了具有清除能力的肽段，使其清除羥基自由基活性下降。顯著性分析結(jié)果表明水解時(shí)間為15，90，120min的酶解樣品之間無顯著性差異，酶解物的分子量和水解時(shí)間與其清除羥基自由基能力不存在相關(guān)性，與其具有活性的肽段有關(guān)。

2.4 清除超氧陰離子（·）的活性

2.5 玉米谷蛋白酶解物的還原力

由圖4可知，Protamex酶解玉米谷蛋白時(shí)，各水解時(shí)間的酶解物均有較高的還原力。水解時(shí)間為90，120min時(shí)，酶解物的還原力較高分別為0.234±0.003和0.236±0.004，該值和0.01mg/mL的Vc溶液相當(dāng)。顯著性分析結(jié)果表明各水解時(shí)間的酶解物還原力相差不大，均有良好的抗氧化能力，與水解時(shí)間和水解度沒有一定的相關(guān)性，可能原因是酶解過程中Protamex的作用位點(diǎn)廣泛，專一性不強(qiáng)，酶解物中所含抗氧化肽結(jié)構(gòu)、氨基酸組成及序列差異不大。

圖3 Protamex酶解玉米谷蛋白水解時(shí)間與酶解物對(duì)超氧陰離子抑制活性的關(guān)系Figure 3 Relation between hydrolysis time and superoxide anion scavenging activities of corn glutelin hydrolysate by Protamex

圖4 Protamex酶解玉米谷蛋白水解時(shí)間與酶解物還原力的關(guān)系Figure 4 Relation between hydrolysis time and reducing powers of corn glutelin hydrolysate by Protamex

2.6 玉米谷蛋白酶解物與亞鐵離子螯合的能力

由圖5可知，Protamex水解玉米谷蛋白時(shí)，各水解時(shí)間的酶解物與亞鐵離子均有一定的螯合能力。水解時(shí)間為15 min時(shí)，酶解物即具有與亞鐵離子的螯合能力，肽鍵斷裂，暴露出具有活性的氨基酸，如組氨酸是常見的具有與金屬螯合能力的氨基酸。延長(zhǎng)水解時(shí)間對(duì)亞鐵離子螯合能力提高顯著，酶解時(shí)間120min時(shí)，酶解物與亞鐵離子螯合能力達(dá)到最高值為（29.92±2.96）%，而Vc溶液對(duì)亞鐵離子幾乎沒有螯合作用，這與楊雙等［15］的報(bào)道一致。玉米谷蛋白酶解物與亞鐵離子的螯合能力雖然不高，但是可以在一定程度上減緩蛋白質(zhì)被氧化，是非常重要的天然抗氧化劑。

圖5 Protamex酶解玉米谷蛋白水解時(shí)間與酶解物與亞鐵離子的螯合能力的關(guān)系Figure 5 Relation between hydrolysis time and Fe2＋-chelating abilities of corn glutelin hydrolysate by Protamex

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，Protamex水解玉米谷蛋白時(shí)，各水解時(shí)間下酶解物都具有抗氧化活性，抗氧化能力都有差異。酶解物的抗氧化活性與水解時(shí)間和水解度沒有相關(guān)性，酶解物中大分子肽段和小分子肽段均具有一定的抗氧化活性。Protamex酶解時(shí)間為120min時(shí)的酶解物具有較高的抗氧化活性，可能與其活性肽段有關(guān)，因此通過控制Protamex水解玉米谷蛋白的時(shí)間可以得到具有高抗氧化活性的酶解物，將對(duì)玉米谷蛋白的應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。其中Protamex水解玉米谷蛋白的水解度和分子量分布與其抗氧化活性的關(guān)系需要進(jìn)一步的試驗(yàn)。

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