尾氣分析在發酵食品行業中的應用

董克武 黎 路

（上海舜宇恒平科學儀器有限公司，上海 200233）

發酵食品是利用有益微生物加工制造的一類食品，具有獨特的風味和一些特異性營養因子，有些功能性發酵食品因具有某種生理活性物質還可以起到調節機體生理功能的作用［1］。常見的發酵食品有氨基酸、有機酸、酶制劑、酵母、淀粉及淀粉糖、多元醇和特種功能的發酵制品等。發酵食品的生產過程需要利用微生物體的代謝作用，并借助于對代謝過程的控制來獲得所需產品，其中包括大量復雜的生化反應和遷移現象，不同種類的微生物利用碳水化合物、蛋白質等原料，采用不同的代謝途徑產生各種代謝產物［2］。生物發酵反應代謝過程中的參數變化，如：溫度、酸堿性、氧化還原電位、溶解氧、尾氣組分等，是發酵過程狀態的實時反映。在現代化的食品研究和生產中，為了獲得更好的產品和更高的產率，提升市場競爭力，就需要通過在線監測實時跟蹤這些發酵過程關鍵參數的變化，實施調控優化發酵過程［3］。

1 尾氣分析的意義

在溫度、pH、溶解氧、尾氣組分等參數中，尾氣組分濃度的變化反映了整個發酵過程中物質的變化情況，尤其對于耗氧和兼性好氧發酵來說，尾氣中CO2和O2的變化，反映了發酵過程中微生物的代謝狀態和代謝途徑，已經被作為衡量發酵水平的重要指標氣體［4，5］。通過在線檢測CO2和O2的變化，可以計算獲得攝氧率（oxygen uptake rate，OUR）、二氧化碳釋放速率（carbon-dioxide escape rate，CER）、呼吸熵（respiratory quotient，RQ）等呼吸代謝參數。OUR是單位時間、單位體積發酵液中細胞消耗的氧氣量，CER是單位時間、單位體積發酵液中細胞釋放的二氧化碳量，RQ是CER除以OUR所得的商［6］，這些指標直接反映了細胞的生長代謝狀態，對于發酵狀態識別、供氧控制優化、流加補料以及故障預判等，都具有指導意義。尤其在工業發酵的放大過程中，大罐和小罐的細胞代謝特性是否一致是放大成功與否的關鍵，而要達到此目標，細胞代謝相關的宏觀生理參數尤為重要，這些參數在工業規模的發酵大罐中與實驗小罐一致時，發酵過程的放大就會取得成功［7］。

2 尾氣分析的主要方法

目前，發酵尾氣的檢測方法主要有基于紅外和順磁原理的尾氣分析儀［8］和過程氣體質譜分析儀［9，10］。尾氣分析儀只能檢測氧氣和二氧化碳的含量，采樣密度也不能太大，一臺儀器一般僅能同時監測四路發酵尾氣。而近年來，過程氣體質譜分析技術悄然興起，并具有很好的應用潛力。與尾氣分析儀相比，過程氣體質譜分析儀具有分析速度快、檢測精度高、可監測通道數多、可同時檢測多種氣體組分等優勢［11］。早在20世紀90年代，就已經有質譜儀應用于啤酒酵母的研究中［9］，對攝氧率進行測定。

過程氣體質譜分析儀是基于先進的質譜技術原理，不僅能夠進行快速、準確和高靈敏度的檢測，還提供了解未知物質結構的途徑，在研究反應機理和監測反應過程的應用中發揮重要作用。其基本原理和分析過程是：氣體分子進入離子源，經電離形成不同質荷比（m/z）的離子，由于不同離子在磁場或電場的運動軌跡不同，離子在質量分析器中按照質荷比分開，依次到達檢測器而得到質譜圖，根據離子豐度及豐度比得到樣品的分析結果［12］。因此質譜儀的分析速度非常快，可達到ms級，遠遠高于尾氣分析儀的響應速度，在多通道檢測應用中具有顯著優勢。一臺質譜儀即可同時監測多臺發酵罐，根據發酵尾氣檢測周期的需要，可以同時監測十幾甚至幾十個發酵位點（見圖1）。對于大規模的工業生產來說，大大降低了設備的購置費用。除此以外，質譜技術能夠實現全組分氣體分析，除了O2、CO2之外，還可同時提供N2、Ar等無機氣體及多種有機氣體定性定量結果，為研究發酵食品尾氣組分，指導和調控產品生產，提供更全面的數據支持。

圖1 質譜儀多通道監測示意圖Figure 1 Online multi-stream off-gas analysis with process mass spectrometer

3 尾氣分析在發酵食品中的應用

3.1 氨基酸

氨基酸發酵在發酵工業中占有重要地位，其發酵生產菌大多數為需氧菌或兼性厭氧菌，發酵液中的氧是菌體生長與代謝的必需品，因此，對發酵過程中氧的調控極為重要，尾氣中O2和CO2的含量可作為實際控制的參考指標［13］。

谷氨酸是目前世界上產量最大的氨基酸，它不僅是日用調味品味精、雞精的主體，同時也是其他氨基酸制品、多種化學品、醫藥品、保健食品的重要原料，應用非常廣泛［14］。肖杰等［15］在對RQ控制在谷氨酸發酵過程中的應用研究中發現，通過調節操作條件，可改變產酸期的RQ水平，如果將發酵過程中的RQ值控制在較低水平（0.5），TCA循環通量可被控制在合理水平上，谷氨酸脫氫酶的高活力同時也得到保持，在這種較低水平的RQ調控條件下，可以獲得較高水平的谷氨酸發酵產酸率和糖轉化率。

賴氨酸是人體所必須的8種氨基酸之一，目前采用最多的是液態生物發酵法進行生產，亦屬于耗氧發酵，檢測氧的含量對發酵工藝優化和放大具有重要意義［16］。在發酵過程中，通過提高初始糖濃度和選育解除反饋抑制的高產菌株兩種方式，都可以將發酵單位提高一定水平，但是如果在發酵過程中進行控制，將基質更多地轉化為目標產物，提高發酵過程的轉化率，不僅提升了效率，發酵成本也進一步降低［17，18］。

3.2 酶制劑

酶制劑由于具有高效、專一和作用條件溫和等優點，在食品加工等行業得到越來越廣泛的應用。國內外正在使用或開發的酶制劑常用有α－淀粉酶、半纖維素酶、葡萄糖氧化酶、蛋白酶、脂酶、植酸酶等［19］。

畢赤酵母表達系統是近年迅速發展起來的一種優秀的真核表達系統，在表達異源蛋白上具有諸多優點，廣泛應用于酶制劑發酵生產中，在高密度發酵方面具有巨大潛力［20］。畢赤酵母具有強烈的好氧生長偏愛性，在發酵過程中保證氧的供給是提高發酵產量的重要因素，僅靠溶氧往往不能獲得足夠的供氧信息，尤其在溶氧為零的時候。質譜儀測定OUR可直接反映出供氧狀態，既可避免細胞因供氧不足發生代謝異常從而導致產率降低，也可避免過供氧引起的能量消耗以及對細胞可能造成的傷害。另外，畢赤酵母在發酵過程中需要利用甲醇誘導外源蛋白的表達［21］，而甲醇由于其沸點低、易揮發的特點導致其易隨尾氣帶出，質譜儀是通用型檢測儀器，可以通過增加特征監測離子實現對尾氣中甲醇含量的測定，為畢赤酵母發酵過程控制提供更為豐富的參考數據［22］。

木聚糖酶是一類水解植物材料中半纖維素的內切酶，可用于食品、保健品等。張潔等［23］在以木霉菌作為生產菌株，以麩皮和木屑為培養基，在2L柱式反應器中固態培養木聚糖酶的過程研究中，在線監測尾氣中CO2，發現其含量變化與菌體生長和產酶均有密切關系。對尾氣中的CO2進行在線檢測，獲得固態發酵過程中菌體生長和酶生產的動態信息，從而可以進一步建立過程控制模型，為工藝優化提供可靠依據。

3.3 有機酸

有機酸包括乳酸、檸檬酸、葡萄糖酸等，均是常用的食品添加劑。

乳酸具有很強的防腐保鮮功效，不但可以抑菌、延長食品保鮮期，還有調味、保持食品色澤和提高產品質量等作用。王然明等［24］在乳酸發酵工藝控制研究中，應用過程質譜儀分析尾氣，對于乳酸發酵過程代謝進行分析，利用質譜儀分析尾氣對凝結芽孢桿菌發酵乳酸過程進行微耗氧發酵供氧水平的精確控制，將菌體的攝氧率控制在0.70mmol/（L·h）時，凝結芽孢桿菌發酵乳酸的最佳合成速率可以達到2.78g/（L·h）。該研究還發現，尾氣數據也是乳酸發酵終點判斷的有力依據，根據實時尾氣數據獲得生理參數的趨勢變化，及時判定發酵終點，并對發酵過程副產物的代謝進行分析，對提升乳酸產品質量控制起到了非常關鍵的作用。質譜儀提供的尾氣數據對于乳酸發酵產量和質量均有提高，并可實現在線控制。

檸檬酸在食品工業上廣泛用作酸味劑、增溶劑、緩沖劑、抗氧化劑等，被稱為第一食用酸味劑，主要通過黑曲霉利用糖類發酵生成。對其代謝途徑分析，發現RQ是關鍵參數，反映了底物利用情況、胞內代謝網絡通量，與檸檬酸的產量明顯相關，二氧化碳的釋放速率隨著檸檬酸合成速率的增加而迅速下降［25］。因此在檸檬酸的合成過程中，通過在線監測尾氣數據來指導供氧，以控制二氧化碳的羧化利用，從而提高檸檬酸產量和增加轉化率，對于檸檬酸的生產效率和成本控制有重要指導意義［26］。

4 結論與展望

通過監測食品發酵過程的尾氣含量，尋找其中的敏感參數，從而獲得發酵過程的最佳干預點，對于優化發酵過程、提高產量有著重要的指導意義。隨著技術的不斷進步，質譜儀為發酵食品過程監測提供了更為豐富的數據［27］。另一方面，隨著中國科學儀器行業的快速發展，國產過程氣體質譜分析儀也已在生物發酵尾氣監測中廣泛應用，如：上海舜宇恒平科學儀器有限公司自主研發的SHP8400PMS過程氣體質譜分析儀，不僅性能達到了國際先進水平，還針對發酵行業的應用特點完善了系統解決方案。過程氣體質譜分析儀由于其快速響應、數據全面的技術優勢，在發酵食品在線尾氣分析中的應用必將越來越受到關注，為食品發酵工藝優化和過程控制提供可靠的數據支持。

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