醒酒玉米低聚肽的分離制備及其氨基酸序列分析

馬 偉 戴 軍 陳尚衛(wèi) 朱 松（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 141；.江南大學食品學院食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 141）

玉米低聚肽是以玉米蛋白為主要原料，用酶解法（蛋白酶）生產(chǎn)的相對分子量小于1 000、主要成分為肽的粉末狀物質(zhì)［1］，2010年經(jīng)中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會批準作為新資源食品開始使用。玉米低聚肽中富含丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸和脯氨酸等［2］，其特殊的氨基酸組成和連接方式賦予玉米肽多種生物活性，如促進酒精代謝［3］、保護酒精性/化學性肝損傷［4，5］、抗疲勞［6］、抗腫瘤［7］、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性［8］等。

Yamaguchi等［1，3］首先用堿性蛋白酶水解玉米蛋白，得到了有生物活性的玉米肽，并發(fā)現(xiàn)其具有促進酒精代謝作用，并對其醒酒機理進行了初步研究。結(jié)果表明：玉米肽的醒酒作用源于它可以顯著性提高血清中丙氨酸、亮氨酸的濃度，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的輔酶（NAD＋），進而加速血液中乙醇在肝臟中的代謝。

目前，關(guān)于具有醒酒活性玉米低聚肽的報道多集中于玉米蛋白粉的酶解條件的優(yōu)化，而關(guān)于其醒酒活性肽的氨基酸序列報道較少，僅 Ma Zhi－li等［9］給出了一種醒酒活性肽的氨基酸序列為 Q－L－L－P－F。為進一步研究醒酒活性肽的構(gòu)效關(guān)系，進而為開發(fā)高醒酒活性玉米低聚肽產(chǎn)品提供理論依據(jù)，本研究將自制的玉米低聚肽產(chǎn)品經(jīng)凝膠過濾色譜和反相色譜分離分級，以及醒酒活性篩選，獲得醒酒活性較強的級分；該級分再經(jīng)超高效液相色譜—四級桿—飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析，以獲得其氨基酸序列。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗原料

玉米蛋白粉（corn gluten meal，CGM）：粗蛋白含量為62.87%，中食都慶（山東）生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試驗動物

昆明種健康小白鼠，體重（25±2）g，雄性，蘇州中醫(yī)院研究所。

1.1.3 主要試劑

中溫 α淀粉酶 BAN 480L：480KNU/g，丹麥 Novo公司；

Alcalase 2.4L：2.4AU/g，丹麥 Novo公司；

氧化型輔酶I（NAD＋）：上海國藥集團；

乙醇脫氫酶ADH：310U/mg，美國Sigma公司；

SephadesG－15：葡聚糖凝膠，美國GE公司；

乙腈：色譜純，美國Fisher公司；

甲酸：色譜純，美國ROE公司；

乙醇、正丁醇：優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司；

NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4、KH2PO4、明膠、焦磷酸鈉、鹽酸、三氟乙酸、無水乙醇等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

高速冷凍離心機：Avanti J－E型，美國Beckman公司；

雙光紫外可見分光光度計：TU－1900型，北京普析通用儀器有限公司；

氣相色譜儀：GC－2010型，日本島津公司；

恒流泵：HL－2型，上海滬西分析儀器有限公司；

電腦全自動部分收集器：BSZ－100型，上海滬西分析儀器有限公司；

紫外檢測器：HD－3型，上海滬西分析儀器有限公司；

色譜工作站：SEPU3000型，杭州普惠科學儀器有限公司；

冷凍干燥機：SCIENTZ－10N型，寧波新芝生物科技有限公司；

高效液相色譜儀：Waters 2545型，美國沃特公司；

超高效液相色譜—飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀：Wates Acquity UPLC－Waters MALDI Synapt Q－TOF型，美國沃特公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米低聚肽的制備 因原料中蛋白質(zhì)含量不高，故先用中溫淀粉酶對原料脫淀粉，然后以脫淀粉玉米蛋白粉為原料進行酶水解得到玉米粗肽液，再經(jīng)過除雜和脫鹽，最后進行低溫噴霧干燥得到玉米低聚肽成品（COP）。玉米低聚肽的制備工藝流程：

1.2.2 玉米低聚肽的理化指標 按 QB/T 4707—2014執(zhí)行。

1.2.3 體外醒酒活性——乙醇脫氫酶（ADH）活力的測定

參照文獻［10］修改如下：取5mL小管，加入pH 8.8的焦磷酸鈉緩沖液1.5mL，27mmol/L氧化型輔酶I（NAD＋）1.0mL，體積分數(shù)為 11.5%的乙醇溶液 0.5mL，試樣（0.1mg/mL COP溶液或超純水）0.1mL，混勻后置于25℃水浴鍋中溫浴5min，之后向管中加入25℃溫浴的ADH（0.25U/mL）0.1mL。混勻后立即測定其吸光度（A340nm）值，每隔10s讀數(shù)一次，直至每分鐘吸光度的增大值達到穩(wěn)定為止。取最初線性部分計算每分鐘還原型輔酶Ⅰ（NADH）的生成量，ADH的活力（U）以每分鐘生成1μmol NADH時所需的酶量表示。ADH酶活按式（1）計算：

式中：

EADH——ADH酶活，U；

ΔA——340nm處每分鐘吸光度的增加值；

3.2——反應液總體積，mL；

W——酶液中含酶量，mg/mL；

6.2——NADH在340nm處的摩爾吸光系數(shù)。

1.2.4 玉米低聚肽醒酒動物試驗 醒酒動物試驗及量效關(guān)系試驗參照文獻［11］。將昆明種雄性小鼠，飼養(yǎng)1周后隨即分為5組，每組10只。5組分別為空白組（陰性對照）、模型組（陽性對照）、COP低劑量組（0.2mg/g·BW）、COP中劑量組（0.4mg/g·BW）、COP高劑量組（0.8mg/g·BW）。采用灌胃的方式給予COP，灌胃前禁食12h，空白組和模型組分別給予等體積的生理鹽水。30min后除空白組外，其余4組均灌胃50%（V/V）乙醇0.012mL/g·BW，空白組則灌胃等體積的生理鹽水，兩次灌胃總體積不超過0.03mL/g·BW。1h后眼眶取血，將所取血樣于37℃水浴恒溫30min，立即以4 000r/min離心5min取血清，在血清中加入等體積的10%TCA和4μL/mL的正丁醇（內(nèi)標物），再以4 000r/min離心5min，取上清液供測定血清中乙醇濃度用。

將上述處理好的血清樣品用氣相色譜法測定乙醇的濃度，色譜條件：檢測器：FID，溫度250℃；DB－23毛細管色譜柱：60m×320mm×25μm，柱溫70℃；流量：氫氣47mL/min，空氣400mL/min，氮氣1.5mL/min。

1.2.5 凝膠過濾色譜分離COP 色譜分離柱自裝，填料為Sephadex G－15，柱尺寸：60cm×2.6cm；洗脫液：超純水；洗脫流速：1.0mL/min；上樣量：COP 15mL（30mg/mL）；檢測波長：220nm。結(jié)合SEPU3000色譜工作站給出的色譜圖，每6min收集1管，按照分子量大小分為不同級分，將各級分經(jīng)冷凍干燥后得到固形物，然后分別測定其體外醒酒活性，活性最強的級分用于后續(xù)進一步分離純化。

1.2.6 制備型反相高效液相色譜分離純化 將經(jīng)冷凍干燥制得的1.2.5中活性最強的級分，用 Waters 2545制備型高效液相色譜（RP—HPLC）進一步分離純化。色譜柱為 Waters xBridgeTMPrep C18（250mm×19mm，5μm）；柱溫為室溫（20℃左右），進樣量500μL，樣品濃度50mg/mL，流動相流速10mL/min，紫外檢測波長220nm；流動相：A為乙腈（0.05%TFA），B為超純水（0.05%TFA）；梯度洗脫條件：0～30min，5%A～20%A；30～50min，20%A～50%A；50～53min，50%A；53～55min，50%A～5%A；55～60min，5%A。將集分經(jīng)冷凍干燥后得到固形物，分別測定其ADH激活率。ADH激活率按式（2）計算：

式中：

R——ADH激活率，%；

E加肽——玉米低聚肽組ADH酶活，U；

E空白——空白組ADH酶活，U。

1.2.7 UPLC—Q—TOF—MS分離分析 將1.2.6中體外醒酒活性最強的凍干組分，經(jīng)UPLC—Q—TOF—MS進一步分離分析。

（1）液相條件：Wates Acquity UPLC超高效液相色譜儀，色譜柱為 Waters xBridgeTMBEH 130C18（150mm×2.1mm，1.7μm）；柱 溫 45 ℃，進 樣 量 1μL，進 樣 濃 度0.1mg/mL，流動相流速0.3mL/min，PDA檢測器，流動相：A為乙腈，B為超純水（0.1%甲酸）；洗脫條件：0～1min，2%A；1～23min，2%A～40%A；23～25min，40%A～80%A；25～26min，80%A；26～30min，80%A～2%A。

（2）質(zhì)譜條件：Waters MALDI Synapt Q—TOF，離子化方式ESI＋；毛細管電壓3.0kV；取樣錐孔電壓30V；離子源溫度100℃；脫溶劑溫度400℃；脫溶劑氣流500L/h；錐孔氣流50L/h；碰撞能量6/25V；倍增器電壓1 800V。

1.2.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS軟件，所有數(shù)據(jù)以平均值（3次重復）或者以平均值±標準差表示，組間經(jīng)t檢和方差分析對試驗結(jié)果進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米低聚肽的理化指標

由表1可知，通過比較可以發(fā)現(xiàn)自制玉米低聚肽的各項值均優(yōu)于QB/T 4707—2014中的要求。

表1 玉米低聚肽理化指標Table 1 Physical and chemical indicators of corn oligopetides%

2.2 體外醒酒試驗

經(jīng)ADH活力測定，自制玉米低聚肽COP的體外醒酒活性——ADH激活率為（41.73±1.9）%，優(yōu)于市售某玉米低聚肽的ADH激活率（35.69±1.4）%，說明自制的玉米低聚肽COP具有高效的體外醒酒活性。

2.3 玉米低聚肽醒酒動物試驗

圖1 不同劑量玉米低聚肽對小鼠血清中乙醇含量的影響Figure 1 Effect of corn peptides on serum ethanol concentration in mice

由圖1可知，與陽性對照組比較，隨著灌胃COP劑量的增加，小鼠血清中乙醇含量不斷降低，當COP的劑量為0.2mg/g·BW時，小鼠血清中乙醇含量顯著降低（P＜0.05），當COP的劑量為0.4mg/g·BW時，小鼠血清中乙醇含量極顯著降低（P＜0.01），當COP的劑量為0.8mg/g·BW 時，血醇含量降低達到極顯著水平（P＜0.001），乙醇含量降低率達到70.02%。通過動物試驗表明，COP在小鼠體內(nèi)有高醒酒活性，同時不難發(fā)現(xiàn)玉米低聚肽的劑量與小鼠血清中乙醇含量的降低呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

2.4 凝膠過濾色譜分離分級

凝膠過濾色譜（Sephadex G－15）分離COP的洗脫曲線見圖2。按照分子量大小分為5個級分，分別定義為COPⅠ、COPⅡ、COPⅢ、COPⅣ、COPⅤ。5個級分中COPⅢ的體外醒酒活性最強，其ADH激活率為（37.82±1.7）%。多次收集COPⅢ，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮及冷凍干燥后得到固形物用于后續(xù)分離純化。

圖2 Sephadex G－15分離COPFigure 2 Separation of COP by Sephadex G－15

2.5 制備型RP—HPLC分離分級

將經(jīng)凝膠過濾色譜（Sephadex G－15）分離得到的活性較強級分COPⅢ進一步進行反相色譜分離，可分成如圖3所示的21個級分。分別收集這21個級分，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮及冷凍干燥后測定其體外醒酒活性，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，17號級分的體外醒酒活性最高，其ADH激活率為（45.73±2.3）%，組 分 14，15，16，19，20，21 的ADH激活率均超過25%～40%。17號級分用于下一步UPLC—Q—TOF—MS分析，以期得到其氨基酸序列。

圖3 制備反相高效液相分離COPⅢ色譜圖Figure 3 The chromatogram of COPⅢseparated by Preparative RP—HPLC

圖4 反相高效液相分離組分的體外醒酒活性Figure 4 The antialcoholism activity in vitro of the fractions separated by RP—HPLC

圖5 COPⅢ－17級分的反相超高效液相色譜圖Figure 5 The RP—UPLC profile of COPⅢ－17

圖6 COPⅢ－17主峰（RT＝14.86）的 Q—TOF二級質(zhì)譜圖（m/z＝899.5）Figure 6 MS/MS spectrum of the major component of COPⅢ－17

2.6 活性級分的氨基酸序列分析

將17號級分經(jīng)UPLC—Q—TOF—MS分離分析，得到UPLC—UV圖譜和其主成分（RT＝14.86min）的Q—TOF二級質(zhì)譜圖，見圖5、6。采用Biolynx軟件對該主成分的碎片離子進行解析，得到其氨基酸序列為P－Y－L－P－L－L－P－S，斷裂模式見圖6。

3 結(jié)論

經(jīng)體外ADH活性試驗及動物試驗表明，在本研究給出的水解條件下制得的玉米低聚肽產(chǎn)品COP具有較高的體內(nèi)外醒酒活性，COP的劑量與小鼠血醇含量的降低呈現(xiàn)明顯的劑量—效應關(guān)系。經(jīng)UPLC—Q—TOF—MS分析，初步得到最強活性組分的分子量為899.5，其氨基酸序列為：P－Y－LP－L－L－P－S。本研究為進一步開發(fā)玉米蛋白資源及高醒酒活性玉米低聚肽產(chǎn)品提供了新的依據(jù)。

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