靈芝菌絲體多糖的分離純化及其單糖組成分析與分子量測定

王海燕 戴 軍 陳尚衛（.江南大學食品學院，江蘇 無錫 40；.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 40）

靈芝（G.lucidum）屬擔子菌綱、多孔菌目、靈芝科、靈芝屬［1］，按其生長過程可分為菌絲體、子實體和孢子粉3個階段。中國靈芝屬真菌有75種，常見的有赤芝、紫芝、黑芝、松杉靈芝等。近年來，研究發現靈芝具有降血糖［2，3］、降血脂［4］、免疫調節［5］、抗腫瘤［6］、抗氧 化［7］等保健功 能，其主 要功效成分為多糖和三萜［8］。

作為靈芝的主要活性物質之一，靈芝多糖類產品受到人們青睞。野生靈芝極為有限，傳統的固體培養基培植法受到生產周期長、生產效率低等制約，無法實現大規模工業化生產；液體深層發酵靈芝菌絲體多糖具有含量高、培養周期短、可大規模生產和易于標準化等優點［9］，因此其成為研究熱點。

目前，關于靈芝菌絲體多糖的研究主要包括發酵優化、結構分析和活性檢測等方面［10－12］。本試驗為考察前期優化的赤芝菌種在最佳發酵條件下得到的赤芝菌絲體粗多糖的組成特性，對該粗多糖分離純化后分別利用高效體積排阻色譜（HPSEC）、PMP柱前衍生化反相高效液相色譜（RP—HPLC）和多角度光散射（SEC—MALLS）等技術分別研究了各級分多糖的單糖組成、分子量分布以及鏈構象特性，為進一步對該赤芝多糖進行構效關系研究和產品研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

赤芝菌絲體多糖樣品：本實驗室自制；

陰離子交換凝膠：DEAE－Sepharose CL－6B型，美國 GE Healthcare公司；

葡聚糖標準品：Dextran系列，美國Sigma公司；

甘露糖、鼠李糖等12種單糖標準品：＞97%，美國Sigma－Aldrich公司；

乙腈：色譜純，美國Tedia公司；

1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）：99%，美國Acros Organics公司；

三氟乙酸：化學純，國藥集團化學試劑有限公司；

鹽酸、苯酚、硫酸、三氯甲烷、無水乙醇、硝酸鈉、甲醇和氫氧化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀：Waters 1525型，美國Waters公司；

液相色譜系統：Aligent 1200型，安捷倫科技有限公司；

多角度激光光散射儀：DAWN8型，美國Wyatt公司；

可見光分光光度計：722N型，上海精密科學儀器有限公司；

自動收集器及玻璃層析柱（3.2cm×25cm）：BSZ－100型，上海滬西分析儀器廠；

旋轉蒸發儀：RE52－2型，上海亞榮生化儀器公司；

恒溫水浴鍋：HH－2型，江蘇省金壇市新航儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 靈芝菌絲體粗多糖的分離純化 脫蛋白、脫色后，將靈芝菌絲體多糖配制為濃度50mg/mL的水溶液。樣品上DEAE－Sepharose Fast Flow柱（3.2cm×25cm），用自動收集器前后分2次各收集洗脫液100管，第1次以pH 7.8的0.02mol/L Tris—HCl溶液為洗脫液，第2次以0.01～1.00mol/L NaCl溶液和0.02mol/L Tris—HCl溶液梯度洗脫，流速為8mL/min，每分鐘收集1管，每5管（每管取0.2mL，共1.0mL）用苯酚硫酸法［13］于490nm處測多糖的吸光值。收集主要峰組分，用截留分子量為3.5×103Da的透析袋透析48h除鹽后冷凍干燥得GLMP1、GLMP2和GLMP3。

1.2.2 級分多糖的高效體積排阻色譜法（HPSEC）分析 色譜條件參考文獻［14］，GLMP1、GLMP2和GLMP3分別配成濃度約為10mg/mL的水溶液，過0.45μm微孔濾膜后進樣分析。

1.2.3 級分多糖的單糖組成分析

（1）樣品的完全酸水解：將多糖級分別溶于水配成濃度約為5mg/mL的溶液，吸取500μL溶液于具塞試管中，加入2mol/L TFA溶液500μL，充分混勻后充入N2封管，置于110℃烘箱中水解120min，取出冷卻至室溫，加入同體積的甲醇，氮氣吹干，重復3次后以1mL超純水溶解。

（2）混合單糖標樣PMP衍生化：取100μL的混合單糖標準液（各單糖質量濃度均為3mg/mL左右）與等體積0.6mol/L NaOH溶液混合均勻，取50μL上述混合液于5mL具塞試管中，加入0.5mol/L的PMP甲醇溶液50μL，旋渦混勻；70℃下反應100min中，取出冷卻至室溫，加0.3mol/L的HCl溶液60μL中和pH，加水定容至1mL，再加入的1mL氯仿，振蕩使兩相充分接觸，靜置后棄去有機相，重復3次以除去多余的PMP試劑，將衍生化后的溶液過0.45μm微孔濾膜，進樣分析。級分多糖樣品水解產物的PMP衍生化方法與混標衍生化方法相同。

（3）RP—HPLC色譜條件：檢測器：二極管陣列檢測器（DAD）；色 譜 柱：ZORBAX Eclipse XDB－C18（250mm×4.6mm i.d.，5μm）；流動相：0.1mol/L pH 6.7磷酸鹽緩沖液—乙腈（V/V＝83/17）；檢測波長：245nm；柱溫：30℃；流速：1mL/min；進樣體積：20μL

1.2.4 SEC—MALLS分析

（1）SEC—MALLS—RI體系：采用尺寸排除色譜和多角度光散射儀聯用裝置（SEC—MALLS）測試試樣的重均分子量（Mw）、多分散系數（Mw/Mn）及均方根旋轉半徑（RMS）。多角度激光光散射儀（MALLS）波長為633nm，用茁霉多糖（Mw＝1.18×104，Mw/Mn＝1.10）做為標樣進行歸一化。尺寸排除色譜裝置分別使用水體系的Shodex OHpak SB－805HQ和Shodex OHpak SB－804HQ 兩根色譜柱串 聯 和 示 差 折 光 檢 測 器 （RI－150，Thermo Finnigan，USA）。

（2）測試條件：流動相：0.2mol/L的 NaCl水溶液；流速：0.5mL/min；測試溫度：25℃；進樣量：200μL。

（3）樣液制備：多糖級分分別溶于0.2mol/L的NaCl水溶液中，樣品濃度為1mg/mL。進樣前樣品及流動相經過0.2μm濾膜過濾。

2 結果與分析

2.1 靈芝菌絲體多糖的分離純化

通過DEAE－Sepharose Fast Flow柱的洗脫液以管數為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制洗脫曲線（圖1），按照出峰順序先后收集得到3個多糖級分分別命名為GLMP1、GLMP2和GLMP3，級分組分透析除鹽后凍干供后續分析。

圖1 靈芝菌絲體多糖通過DEAE－Sepharose Fast Flow柱洗脫曲線Figure 1 Elution curve of Ganoderma lucidummycelium polysaccharide on DEAE－Sepharose

2.2 級分多糖的高效體積排阻色譜法（HPSEC）分析

純度的概念是隨著分離分析手段的進展而不斷發展的，多糖是結構復雜的生物大分子，它的純度只代表多糖在某一鏈長的平均分布，因此通常意義上的多糖純度是指多糖在一定分子量范圍的均一分布［15］。高效體積排阻色譜（HPSEC）具有快速、高分辨率和重現性好的優點，是目前最常見的鑒定多糖純度的方法。由圖2可知，除少量雜峰外3個級分均為單一對稱的峰型，可以視為均一的多糖。

圖2 GLMP1、GLMP2和GLMP3的HPSEC圖譜Figure 2 HPSEC elution profile of GLMP1，GLMP2and GLMP3

根據HPSEC圖中峰面積的百分比可知，3個級分多糖的純度分別為93.58%，97.64%，99.19%，少量雜峰為分子量0.5×103Da左右的多糖小分子。同時，以不同分子量的葡聚糖標準品為標樣，根據標樣的保留時間和對應分子量做出分子量校正曲線，再由軟件計算出級分多糖樣品的相對重均分子量（Mw）見表1。

表1 3個級分多糖的相對重均分子量及純度結果Table 1 The relative Mwand purity results of three polysaccharide fractions

2.3 單糖組成分析結果

12種單糖標樣的PMP衍生化RP—HPLC色譜圖見圖3，在該色譜條件下12個單糖峰的分離效果較好。

GLMP1、GLMP2和GLMP3的單糖組成見圖4～6，與圖3中標準品的保留時間對照可知，GLMP1、GLMP2和GLMP3均含有甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、半乳糖醛酸（GalUA）、葡萄糖（Glu）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）和巖藻糖（Fuc）。Ferreira等［16］研究發現液體深層發酵靈芝多糖的單糖組成中Ara來自于發酵液多糖而非菌絲體多糖。

圖3 12種單糖PMP衍生物的RP—HPLC圖譜Figure 3 Chromatograms of PMP derivatives of twelve kinds of monosaccharides by RP—HPLC

圖4 GLMP1PMP柱前衍生化的RP—HPLC圖譜Figure 4 RP—HPLC chromatograms of GLMP1by PMP derivatives

圖5 GLMP2PMP柱前衍生化的RP—HPLC圖譜Figure 5 RP—HPLC chromatograms of GLMP2by PMP derivatives

由表2可知，3個多糖級分均含有 Man、Rha、GalUA、Glu、Gal、Xyl、Ara和Fuc，但它們的單糖摩爾比差異較大。分子量最大的GLMP1中Xyl最多，其次是Gal、Ara和Fuc，前期研究［17］表明Xyl有助于提高多糖的抗氧化活性。GLMP2含Gal最多，其次是Xyl、Glc和Ara且這3種單糖含量接近，單糖組成分析中Gal含量較多的多糖可以顯著地增強免疫活性［18］。分子量最小的GLMP3中Glc含量最多，其次是Gal，而其他6種單糖含量較少。分子量大的GLMP1和GLMP2中單糖組成種類更豐富，并且表征高生物活性的單糖含量更高。

圖6 GLMP3PMP柱前衍生化的RP—HPLC圖譜Figure 6 RP—HPLC chromatograms of GLMP3by PMP derivatives

表2 3個級分多糖的單糖組成（摩爾比）Table 2 Monosaccharide composition of three polysaccharide fractions

2.4 多糖級分的液相色譜—多角度激光散射聯用（SEC—MALLS）分析

通過示差折光（RI）檢測器信號和光散射（90°）獲得3個多糖級分的色譜圖，見圖7。SEC—MALLS經普適校正測定GLMP1、GLMP2和GLMP3的絕對重均分子量（Mw）分別為4.526×105，4.603×104，3.760×103g/mol，這與2.2中所測得的相對重均分子量有一定差異。HPSEC方法中，葡聚糖和多糖樣品結構有一定的差異性，以葡聚糖為標樣測得的相對重均分子量誤差更大，不能準確表示級分多糖的分子量。SEC—MALLS直接測出多糖樣品圖譜中每個點的絕對分子量，無需進行任何色譜柱標定和標準品參考，測定結果更精確。

此外，分子量分布情況可由Mw/Mn的比值顯示，當該值越大時，分子量分布就越寬即分散度就越大。對于窄的分子量分布，其Mw/Mn比值接近1［19］。由表3可知，3個多糖級分的Mw/Mn比值分 別為1.559，1.360，1.125，表 明GLMP1和GLMP2中度分散，而GLMP3分子量分布區間較窄。另外，ASTRA軟件分析可獲得樣品的構象，即由分子旋轉半徑RMS與分子摩爾數之間的關系曲線可得，該關系曲線用α表示。Wyatt［19］認為當α值小于或等于0.33時大分子是一個緊密均勻的球形構象；而α值在0.2～0.4可以說明大分子為高支化的緊縮鏈構象；直線斜率在0.5～0.6，表明大分子是一個無規則線團構象。3個級分多糖的α值皆在0.3～0.4，表明 GLMP1、GLMP2和 GLMP3均為緊密且具有高度分枝結構的大分子聚合物，其中GLMP2可能是球形構象。

圖7 級分多糖的光散射（LS）和RI檢測器的色譜圖Figure 7 Chromatograms obtained by SEC with LS and RI of three polysaccharide fractions

表3 SEC—MALLS—RI測定多糖級分的分子特性Table 3 Molecular characteristics of three polysaccharide fractions by SEC—MALLS—RI

3 結論

前期優化后的赤芝菌種經液體深層發酵，獲得的靈芝菌絲體粗多糖經DEAE－Sepharose CL－6B分離純化得到3個多糖級分GLMP1、GLMP2和GLMP3，HPSEC檢測3個級分多糖純度都較高，可視為均一的多糖級分。PMP衍生化RP—HPLC結果顯示GLMP1、GLMP2和GLMP3均含有Man、Rha、GalUA、Glu、Gal、Xyl、Ara和 Fuc，與之前報道的靈芝菌絲體多糖的單糖組成略有差異［20］，這可能跟靈芝菌種、培養條件等因素有關。采用SEC—MALLS—RI測試GLMP1、GLMP2和GLMP3的絕對重均分子量（Mw）分別為4.526×105，4.603×104，3.760×103g/mol，并且根據分子旋轉半徑與分子摩爾數的關系曲線斜率α可知，3個多糖級分構象可能均為高度緊縮且具有分支結構的聚合物。本研究為赤芝菌絲體多糖的構效關系研究提供結構基礎，有利于該多糖的產品開發。

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