大葉白麻中總黃酮超臨界CO2萃取工藝優化

史俊友 景年華 李彩霞（曲靖師范學院，云南 曲靖 655011）

大葉白麻（Poacynum hendersonii），為夾竹桃科白麻屬的一種多年生草本植物，與羅布紅麻和白麻并稱為“羅布麻”［1，2］。其具有延緩衰老、降壓、降脂、抗感冒、鎮靜安神等作用［3－5］，常與羅布紅麻一起被用來制作降壓藥和保健食品。研究表明，大葉白麻葉中含有酚類、鞣質、多糖、黃酮、強心苷、內酯、香豆素、甾體等物質［6］，其中黃酮含量最高且被認為是其主要藥效成分，約占大葉白麻葉總質量的5%～6%［7］。目前已確定的黃酮類成分包括異槲皮苷、槲皮素、紫云英苷、三葉豆苷、金絲桃苷、新異蕓香甙、異槲皮苷－6′－O－乙酰基、三葉豆苷－6′－O－乙酰基8種物質［8－10］。定量分析表明，異槲皮苷、槲皮素－3－O－槐糖苷和異槲皮苷－6′－O－丙二酸酯為含量最高的3種成分［11］，其中異槲皮苷，又稱羅布麻甲素，具有良好的降壓效果，是羅布麻藥材中具有代表性的活性黃酮類化合物［12］。因此，大葉白麻葉中總黃酮的高效提取對于開發利用大葉白麻資源具有重要的意義。

目前大葉白麻中總黃酮的提取方法有熱水提取法、乙醇提取法、丙酮提取法［13］、堿性稀醇提取法、超聲提取法［14］等，但國內外尚無利用超臨界CO2流體萃取大葉白麻中黃酮的相關報道。超臨界CO2萃取具有能耗小、效率高、無污染、條件溫和等優點，同時還可通過改變臨界溫度和壓力達到選擇性提取、分離、純化的目的［15－17］，目前在天然產物有效成分的提取中應用越來越廣泛。本試驗擬以大葉白麻葉為原料，以乙醇作為夾帶劑，采用正交設計方法對大葉白麻中總黃酮的超臨界萃取（SCDE）工藝進行優化，旨為大葉白麻總黃酮的開發利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大葉白麻葉：采摘于青海省格爾木市；

二氧化碳：食品級，云南昆明特種氣體廠；

蘆丁對照品：純度98%，中國藥品生物檢定所；

無水乙醇：分析純，天津光復精細化工公司；

硝酸鋁：分析純，上海艾比化學試劑有限公司；

亞硝酸鈉：分析純，天津恒興化學試劑制造有限公司；

超臨界流體萃取儀：HA221－40－10＋2型，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；

紫外分光光度計：TU1810型，北京普析通用儀器有限責任公司；

電子天平：MSE323S型，德國賽多利斯公司；

電熱鼓風干燥箱：DZF－6050型，北方利輝試驗儀器設備有限公司；

中草藥粉碎機：FW177型，天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理 將采摘的大葉白麻葉用清水洗凈后于陰涼處陰干，在烘箱中于70℃條件下烘烤4h，取出，放入中藥粉碎機中粉碎，過20目篩備用。

1.2.2 大葉白麻總黃酮的提取 稱取已粉碎的大葉白麻樣品150g裝入萃取裝置，將超臨界萃取儀調節至預定參數后進行超臨界萃取，不斷加入選定的夾帶劑乙醇，并控制夾帶劑流速在6～10mL/min，后改變夾帶劑濃度、夾帶劑酸堿度、萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、夾帶劑用量等參數，于各不同條件下提取大葉白麻總黃酮［18，19］。

1.2.3 單因素試驗設計

（1）夾帶劑濃度的確定：因CO2為非極性物質，單純的超臨界CO2流體很難對極性較大的黃酮類物質進行高效萃取［20］。根據預試驗的結果，充分考慮試驗安全性和經濟成本因素，本試驗選擇乙醇作為夾帶劑。在夾帶劑pH＝7的條件下，固定夾帶劑用量600mL，萃取時間120min，萃取溫度45℃，萃取壓力20MPa，CO2流量30L/h的條件下，分別選擇濃度為50%，60%，70%，80%，90%的乙醇做夾帶劑進行萃取試驗。

（2）夾帶劑酸堿度的確定：選定70%乙醇為夾帶劑，在萃取壓力20MPa，萃取溫度45℃，CO2流量30L/h，夾帶劑用量600mL，萃取時間120min的條件下，考察pH值［14］分別為6，7，8，9，10，11時對黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交試驗 在確定夾帶劑的濃度和酸堿度后，在預試驗和文獻［17～19］的基礎上，本試驗以夾帶劑的用量、壓力、時間、溫度等作為影響因素，根據L9（34）的正交表設計正交試驗，并進行了四因素三水平的正交試驗，以確定最佳工藝，具體設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels list of orthogonal tests

1.2.5 總黃酮含量的測定 根據文獻［21］和［22］，修改如下：準確稱取經減壓干燥至恒重的蘆丁對照品10.0mg，置于10mL容量瓶中，加入60%乙醇適量使之完全溶解，用水稀釋至刻度并搖勻，即得濃度為1.0mg/mL的蘆丁標準品溶液。準確吸取蘆丁標準品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，置于10mL容量瓶中，分別加30%乙醇至溶液總體積為5.0mL，后加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，再放置6min，加1mol/L氫氧化鈉溶液4mL，分別用水稀釋至刻度，搖勻，靜置15min后分別在510nm處測定不同濃度蘆丁標準品的吸光度。采用最小二乘法得線性回歸方程：A＝0.032 1c＋0.082 3（r2＝0.999 4）。準確吸取大葉白麻黃酮粗提液1.0mL，加入60%乙醇溶液4mL，后采用與上文相同的顯色方法測定大葉白麻葉中總黃酮含量。本試驗所涉及樣品均平行測試3次，后求平均值。

2 結果與討論

2.1 夾帶劑濃度對大葉白麻總黃酮提取率的影響

由圖1可知，夾帶劑乙醇的濃度對大葉白麻總黃酮提取率影響顯著，隨著乙醇濃度的提高，黃酮類化合物提取率不斷增加，當乙醇濃度達到70%以后，隨著乙醇濃度增大總黃酮得率略有下降，故宜選擇70%乙醇作為夾帶劑。此結果與王寧［6］、張永秀［13］等采用溶劑提取法所得結果一致，其原因是大葉白麻中黃酮類物質多為黃酮苷［11］，極性較大，故中等極性的溶劑更為適合。當乙醇濃度稍低時，溶劑極性過大，黃酮提取率較低，同時存在萃取釜內樣品板結的情況；當乙醇濃度較高時，夾帶劑極性較小，不適合大葉白麻總黃酮的提取。故采用濃度70%左右的乙醇提取大葉白麻總黃酮。

圖1 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Figure 1 The influence of ethanol's different concentrations on the extraction rate of flavonoids

2.2 夾帶劑酸堿度對大葉白麻總黃酮提取率的影響

因黃酮中酚羥基顯酸性，故黃酮類物質可溶于堿性溶劑，但難溶于酸性溶劑，選擇合適的夾帶劑pH值對提高黃酮化合物的提取率具有促進作用。由圖2可知，適當提高pH值可提高總黃酮提取率，當pH值為10時總黃酮的提取率最高，故后續試驗中采用pH值為10的乙醇為夾帶劑提取大葉白麻中的總黃酮［19］。

圖2 夾帶劑酸堿度對總黃酮提取率的影響Figure 2 The influence of ethanol's pH value on the extraction rate of flavonoids

2.3 正交試驗結果

由表2可知，各因素中對大葉白麻總黃酮提取率影響最大的為溫度，其余因素的大小程度依次為：夾帶劑用量＞萃取時間＞萃取壓力。提取大葉白麻黃酮類化合物最佳工藝條件為：A1B1C2D3。按照最佳工藝條件進行3次驗證實驗，測得大葉白麻中總黃酮的平均提取率為5.28%，優于正交設計中的任意一個組合。另外，該方法的提取率高于前人［6，13，14］所采用的各種溶劑提取法，詳見表3。

表2 正交試驗結果及數據分析Table 2 Results of orthogonal tests and data analysis

表3 大葉白麻總黃酮不同提取方法比較Table 3 The comparation of different extraction methods for total flavonoids fromPoacynum hendersonii

3 結論

本試驗采用超臨界CO2流體萃取技術對大葉白麻中總黃酮的提取工藝進行了優化，確定了超臨界CO2流體法萃取大葉白麻總黃酮的最佳工藝條件：夾帶劑為70%乙醇，在pH值為10的情況下，提取所需溫度為45℃、壓力為20MPa、提取時間為2h。在此條件下，大葉白麻總黃酮平均提取率為5.28%。與常規溶劑回流提取法相比，其操作簡單、提取率高、活性成分保存好、品質高，是一種很好的大葉白麻總黃酮分離技術。夾帶劑的使用雖然提高了萃取率，但同時也導致了樣品的溶脹甚至板結的問題，且在使用過程中夾帶劑含水量不宜過高，建議在50%以下。

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