物理法結合酶法脫除堅果類過敏原的技術研究

趙 晶 張愛琳 何新益 范建濤

(1.天津市寧河縣產品質量監督檢驗所，天津 301500;2.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300384)

近年來，全球食物過敏的發生率已呈上升趨勢，已經嚴重地影響了部分人群的生活質量甚至危及生命，引起了各國尤其是發達國家的高度關注［1］。全球過敏癥受累人群超過25%，在西方發達國家，成年人食物過敏癥發生率超過1%;而嬰幼兒和兒童發生率達到了5% ～10%［2］;在中國，北京協和醫院變態反應科對就診患者的調查顯示，每年約有1.5萬患者為食物過敏［3］。據統計［4］，170多種食物能夠引起過敏反應，其中，90%以上過敏反應是由八大類高致敏性食物引起，包括牛乳、蛋類、花生、大豆、小麥、堅果、魚和水生貝殼類動物。為了防止消費者誤食過敏性食物，美國、日本和歐盟都頒布了食物標簽法，要求對食品中的8大類食物過敏原進行標注［5］。華南理工大學、中國農業大學、江南大學、中國海洋大學、集美大學、南昌大學［6－10］等關于大米、蝦、牛奶、花生等的過敏源檢測及脫敏技術研究已見報道，但對堅果過敏原的脫敏方法還未見報道。本研究擬通過SDS—PAGE電泳技術及Western-blotting免疫印跡技術分析堅果蛋白的大致分子量及致敏性;采用高溫、高壓、超聲波—微波協同萃取技術等物理手段和蛋白酶處理堅果過敏蛋白，通過雙夾心抗體ELISA酶聯免疫試驗方法檢測堅果過敏蛋白的致敏效價，探索降低或脫除堅果過敏蛋白的最佳方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

堅果過敏陽性血清:從致敏模型陽性試驗小鼠采集，免疫IgE濃度為100g/L;

核桃:產自天津薊縣;

黑芝麻:產自遼寧省丹東市;

開心果:產自蔚縣黃梅鄉;

腰果:產自伊朗;

HRP標記山羊抗人IgE抗體(進口):艾美捷科技有限公司;

堅果過敏病人陽性血清(7人混合):天津市總醫院;

鄰苯二胺:分析純，天津大學科威公司;

牛血清白蛋白:標準品，北京智杰方運有限公司;

胰蛋白酶:比活力＞2500NFU/mg，上海鶴善實業有限公司;

胃蛋白酶:比活力3800NFU/mg，上海雅心生物技術有限公司。

1.2 試驗儀器

電泳系統:Mini-PROTEAN型，美國BIO-rad公司;

微波超聲波聯合萃取儀:CW-2000型，江蘇榮華儀器有限公司;

凝膠成像系統:GL2200PRO型，美國Kodach公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白質的粗提取

(1)粉碎:各類堅果去殼及膜質內種皮后，置于(30±1)℃烘箱中干燥48h，烘干后的堅果于冰浴中研磨成分，過40目篩，備用。

(2)去脂:堅果粉與石油醚以1︰10(m︰V)的比例充分混合后置于4℃，每隔1h攪拌1次，6～8h后更換石油醚，重復3～4次后，直到堅果粉呈白色為止，于4℃下放置，直至石油醚揮發完全。

(3)堅果蛋白的提取:稱取脫脂后的堅果粉與 Tris—HCl緩沖液(TBS，0.2mol/L、pH7.4)以 1 ︰10(m︰V)的比例充分混合均勻，然后于4℃浸提24h，期間每隔1～2h攪拌一次，之后在4℃、5000r/min離心15min，最后收集的上清液為堅果蛋白的Tris—HCl提取液。

(4)堅果蛋白提取物的硫酸銨分級沉淀:首先通過飽和度差值為20%的硫酸銨進行分段沉淀。硫酸銨研磨成粉末，4℃冷卻備用。量取50mL蛋白粗提液在離心管中，先加入硫酸銨使硫酸銨飽和度為40%，充分溶解后4℃靜置1h，之后在5000r/min、4℃離心30min，然后棄去沉淀，收集上清液備用;上清液中再加入適量硫酸銨粉末，使硫酸銨飽和度達80%，同上操作，得沉淀。

(5)透析:沉淀分別用少量 TBS(0.01mol/L、pH8.0)溶解，置于透析袋(截留分子量8kDa)中，用相同的 TBS4℃透析，BaCl2檢測至無硫酸銨為止。透析液置于冷凍干燥機中凍干即為堅果蛋白粗提物，4℃貯藏備用。

1.3.2 考馬斯亮藍法測蛋白濃度及標準曲線繪制 參照文獻［6］。

1.3.3 蛋白質的處理方法

(1)高溫高壓處理:取濃度約為1.0mg/mL的4種堅果蛋白各2mL，置于壓力為102.9kPa，溫度為121℃的高壓鍋內處理20min，處理時管塞切勿塞得過緊，以免蛋白溶液噴射出來。處理后于冰箱內冷凍保存。

(2)微波—超聲波聯合處理:根據前期單因素試驗結果，分別取4種堅果蛋白溶液在CW-2000微波超聲聯合萃取儀進行如表1的正交處理。由于蛋白樣品有限，處理時選取100mL的玻璃瓶，清洗時勿使底部鐵塊沾到水。處理后的蛋白冷凍保存。

表1 正交試驗設計Table1 Thedesignoforthogonalexperiment

(3)酶處理:分別取經高溫高壓和微波超聲聯合處理后的蛋白溶液各1mL，于37℃ pH7.8的條件下用活力單位為2000U，稀釋濃度為0.25%胰蛋白酶處理5min，pH2.0的條件下用活力單位為2800U，稀釋濃度為0.7μg/mL胃蛋白酶處理5min，處理后冷凍保存。

1.3.4 免疫印跡方法鑒定過敏原

(1)SDS—PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳配置方案:凝膠配置比例見表2。

(2)轉膜:① 膠的處理:膠切成適當大小，放于負極緩沖液中平衡15min;②膜的處理:膜PVDF切成與膠相同大小，在甲醇中浸泡15s再放于bufferⅡ中至少5min;③貼膜順序:按照陽極、兩層濾紙(于bufferⅠ中浸泡)、1層濾紙(于buffer中浸泡)、PVDF膜、膠、3層濾紙(浸泡于負極緩沖液)、負極的順序疊加;④轉膜完畢后，用TBST+5%的脫脂奶粉于4℃封閉過夜。

表2 凝膠配置比例Table2 TheratioofGelallocation mL

(3)免疫反應:①將封閉過夜的PVDF膜用PBS清洗5次，每次10min。洗完后用 TBST洗膜5次，每次10min;②將膜置于過敏者血清中，按照1︰2000的比例用TBST稀釋，于37℃溫育1h，然后棄一抗，用TBST洗膜5次，每次10min;③ 洗膜后，將膜置于1︰5000稀釋的二抗中溫育1 h，震蕩。然后用TBST洗膜5次，每次10min;④ ECL顯色:穩定劑與增強型發光劑按1︰1混合，均勻滴到膜上，顯色1 min。

1.3.5 數據統計及圖形分析 用Excel2003統計分析所有數據，計算誤差并制圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白質標準曲線的繪制

采用考馬斯亮藍法配制標準蛋白后測得的標準蛋白曲線見圖1。

由圖1可知，蛋白質含量的標準曲線方程為y=0.5338x+0.0144，R2=0.9974，方程呈線性相關。

圖1 蛋白質標準曲線Figure1 ThestandardcurvesofBCA

2.2 蛋白得率測定

采用考馬斯亮藍G-250法測定各堅果蛋白含量，根據標準曲線方程，計算出蛋白得率(樣品平行測定3組，取平均值)，結果見圖2。

圖2 蛋白得率Figure2 Proteinyieldofthenuts

由圖2可知，蛋白質得率效果最高的是開心果樣品，提取得率最低的是核桃樣品，蛋白得率為42.1%，綜合各堅果的特性，本提取方法對4種堅果樣品均有較好的提取效果。

2.3 超聲波—微波正交處理結果

選取腰果蛋白進行超聲波—微波聯合處理正交試驗，并測定處理后的蛋白含量，見表3。

表3 腰果蛋白超聲波—微波正交處理結果Table3 TheorthogonalprocessingresultsofultrasonicmicrowaveonCashewprotein

由表3可知:各試驗因素主次順序為:B＞C＞A，最優工藝組合為B3C1A2，即240s、90℃、700W。同時，通過對各影響因素與空列組R值的比較，發現B，C兩因素的R值低于空列組，說明微波處理中選擇合適的溫度和功率對脫敏效果有較大的影響，而因素A的R值高于空列組，說明微波處理的時間對脫敏效果影響不明顯。對脫敏效果有影響的其他因素如壓力、超聲波頻率或樣品的破碎程度等還沒有進行分析，對此，課題組還將在后期進一步增加正交試驗的影響因素，并結合免疫印跡及SDS—PAGE電泳加以分析驗證。

2.4 堅果過敏蛋白分離純化SDS—PAGE電泳分析和蛋白粗提液免疫印跡結果

取3種堅果蛋白分別用上樣緩沖液稀釋到1mg/mL后上樣，進行電泳，結果見圖4。采用對堅果類食品過敏者陽性混合血清為一抗，HRP標記山羊抗人IgE抗體為二抗，ECL顯色法進行顯色對3種堅果蛋白的過敏原進行了免疫印跡分析，在暗室中根據結果調整曝光時間以得到最佳結果，見圖3。

由圖3可知，各堅果樣品都含有多種蛋白成分。最富集的各樣品條帶分別為腰果23kU和13kU、杏仁15kU和25 kU、核桃13kU和24kU。由免疫印跡圖可以看出，每種堅果蛋白都能使陽性血清產生致敏性，腰果有兩個過敏條帶，在32kU和42kU附近，42kU附近的條帶為主要過敏原。核桃只有一個過敏條帶，在35kU附近。杏仁也只有一個過敏條帶，在42kU附近。

2.5 物理法結合酶法處理后蛋白的免疫印跡結果對比分析

由圖4可知，堅果的過敏原主要是分子量在0.7～100kU的高度糖基化蛋白質，它們分別屬于不同的蛋白質家族。其中Arah1、Arah2和Arah3是主要的致敏蛋白，90%的病人血清都能識別他們。Arah1具有熱穩定性強、耐酶解、不易消化等特性。超聲波—微波聯合處理能使這些肽鍵的作用力弱化，空間構象發生改變，致敏抗原性降低。高溫高壓與酶法聯合處理，該方法幾乎能完全脫除堅果類過敏原蛋白的致敏性，但對腰果的致敏蛋白脫除效果不徹底。蛋白酶可通過引起Arahl和Arah2的聚合反應來降低堅果蛋白的致敏性。由于堅果過敏蛋白Arah1、Arah2、Arah3中抗原決定簇多含有絲氨酸，而蛋白酶能使絲氨酸連鍵斷裂，使其抗原性降低。

圖3 腰果、杏仁、核桃粗提液蛋白SDS—PAGE結果堅果提取過敏原蛋白免疫印跡結果Figure3 ResultofSDS—PAGEtestwestern-blottingtest andontheproteinofnuts

圖4 物理法及結合酶法處理對堅果過敏性的影響Figure4 Theeffectonthetreatmentofphysicalmethod andcombinedwithenzymeaboutnutallergic

3 結論

(1)本研究結果表明超聲波－微波協同處理結合特殊蛋白酶能夠使堅果過敏蛋白變性失活，在作用溫度為90℃、處理時間240s、微波功率700W結合0.25%胰蛋白酶處理5min能使其致敏性幾乎完全脫除，是脫除堅果過敏原的有效方法。

(2)超聲波—微波結合蛋白酶處理能夠脫除堅果過敏原，使結合肽鍵的作用力弱化，空間構象發生改變，致敏抗原性降低，比熱力脫除過敏原效果更好，更加節約成本。

(3)本研究的不足之處是沒有對失去致敏活性的蛋白結構及營養成分進行分析，后期需要繼續研究。

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