宮頸癌組織中miRNA-34c的表達水平分析及其靶基因PLK4的鑒定

張紅紅 劉曉麗 許思娟

·基礎研究·

宮頸癌組織中miRNA-34c的表達水平分析及其靶基因PLK4的鑒定

張紅紅 劉曉麗 許思娟

目的：分析miRNA-34c在宮頸癌組織中的表達水平并鑒定其新的靶基因。方法：利用熒光實時定量PCR（qRT-PCR）檢測甘肅省婦幼保健醫院34例宮頸癌和癌旁正常組織中miRNA-34c表達水平。利用miRNA靶基因預測數據庫預測miRNA-34c新的靶基因Polo樣激酶4（PLK4）。將含有PLK4的3‘UTR片段熒光素酶載體分別與miRNA-34c模擬物或陰性對照共轉染HEK293T細胞，并檢測其熒光素酶活性。在人宮頸癌細胞SiHa細胞中分別轉染miRNA-34c模擬物或陰性對照，利用qRT-PCR法和Western blot法分別檢測靶基因的mRNA和蛋白質的表達水平。結果：與癌旁正常組織相比，miRNA-34c在宮頸癌組織中表達下調。在HEK293T細胞中，miRNA-34c模擬物顯著抑制熒光素酶的活性（P<0.01）。miRNA-34c模擬物顯著下調SiHa細胞中PLK4的mRNA和蛋白質的表達（P<0.01）。結論：miRNA-34c在人宮頸癌組織中表達下調，且能與PLK4的3’UTR結合并下調其mRNA和蛋白質的表達。

miRNA-34cPLK4宮頸癌

宮頸癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，其死亡率居女性惡性腫瘤的首位，其發病率呈升高和低齡化趨勢［1-2］。microRNA（miRNA）是一種長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，通常與靶基因mRNA完全或不完全匹配結合，誘導靶mRNA降解或阻遏其轉錄后翻譯［3-4］。miRNA-34家族包括miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c，在抑制癌癥發生中起到很重要的作用［5］。在miRNA-34家族中，目前對miRNA-34a的研究較多，而對miRNA-34b和miRNA-34c的研究較少。miR-34c有miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p兩個成熟形式，在多種癌細胞中異常表達，包括宮頸癌細胞［6］。已證實miRNA-34c能夠作用于靶基因E2F3、MYCN、Bcl-2和c-Met抑制癌細胞增殖，錨定非依賴生長和誘導細胞凋亡［7-8］，但其許多功能尚未知。本研究將對miRNA-34c在宮頸癌組織的表達水平進行分析，并鑒定其新的靶基因Polo樣激酶4（PLK4），為宮頸癌的治療提供新的靶點和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 樣本取自甘肅省婦幼保健醫院2011年3月至2013年10月收治的34例宮頸癌患者的腫瘤組織及癌旁正常組織（癌旁正常組織距離腫瘤邊緣>5 cm），凍存于液氮中。病理類型為鱗癌19例、腺癌12例、其他3例。

1.1.2 試劑及儀器 Trizol試劑和脂質體2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；RNA反轉錄試劑盒和熒光實時定量聚合酶鏈式反應（real time-quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自日本Takara公司；DMEM培養基購自美國Hyclone公司，FBS-500胎牛血清購自美國Gibco公司；寡核苷酸miRNA-34c模擬物和陰性對照購自廣州復能公司；pmirGLO Vector和雙熒光素酶報告基因檢測系統購自美國Promega公司；PLK4和GAPDH一抗，山羊抗小鼠IgG購自美國Sigma公司；人胚腎細胞株HEK293T，人宮頸癌細胞株SiHa為本科室保存；熒光定量PCR儀Mx3000P購自美國Agilent公司；Power?Pac基礎電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人胚腎細胞HEK293T和人宮頸癌細胞SiHa使用含10%胎牛血清的DMEM培養基在37℃、5%CO2條件下培養。

1.2.2 熒光實時定量PCR 50 mg宮頸癌組織或癌旁正常組織從液氮取出后加入1 mL Trizol試劑勻漿，按照操作說明提取總RNA，分裝于-70℃凍存。按照RNA反轉錄試劑盒說明書操作，逆轉錄條件為30℃、10 min，42℃、30 min，85℃、5 min。合成的cDNA作為模版進行qRT-PCR擴增，反應體系為cDNA 1 μL、上下游引物各0.6 μL（表1）、SYBR Green熒光染料Mix 10 μL、無菌蒸餾水7.6 μL及ROX 0.4 μL。反應條件為94℃預變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火延伸20 s，循環40次，72℃延時5 min。miRNA-34c及PLK4 mRNA的相對表達量通過2-ΔΔCT法計算，ΔΔCT=（待檢樣品基因平均CT-待檢樣品管家基因平均CT）-（對照組基因平均CT-對照組管家基因CT），分別以U6及GAPDH作為內參。

1.2.3 miRNA-34c靶基因預測 為了預測miRNA-34c的作用靶基因，使用TargetScan、miRBase和miRDB 3個數據庫均出現的靶基因為miRNA-34c目標靶基因。

1.2.4 mRNA-34c靶基因熒光素酶報告基因載體構建 在NCBI網站下載靶基因PLK4的3'UTR序列，設計PCR引物。PCR擴增得到的目的片段連接到pM?DTM-T載體，行雙酶切回收目的片段并插入到熒光素酶報告基因載體pmirGLO Vector上，命名為pmir?GLO-PLK4。

1.2.5 熒光素酶活性檢測 將HEK293T細胞接種于96孔板，將50 pmol/L miRNA-34c模擬物（序列AG?GCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC）或陰性對照與構建的80 ng pmirGLO-PLK4質粒共轉染HEK293T細胞。轉染48 h后，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統溶液裂解細胞，檢測熒光強度。

1.2.6 Western blot分析 將SiHa細胞接種于6孔板，miRNA-34c模擬物和陰性對照分別轉染SiHa細胞。48 h后，采用RIPA法提取總蛋白，取30 μg蛋白經10%SDS-PAGE膠分離后，半干轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，分別用抗PLK4小鼠單克隆抗體（1:1 000稀釋），抗GAPDH小鼠單克隆抗體（1:5 000稀釋）孵育過夜，再與山羊抗小鼠IgG孵育1 h，曝光顯色。

1.2.7 MTT法檢測細胞的增殖 SiHa細胞轉染miR?NA-34c模擬物和陰性對照48 h后加入0.5 mg/mL MTT，孵育4 h，并收集細胞，加100 uL DMSO，室溫振蕩10 min。使用酶聯儀在570 nm波長處測定各孔光吸收值（OD），繪制細胞增殖曲線。

1.3 統計學方法

數據采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。熒光素酶計數和miRNA-34c模擬物抑制PLK4 mRNA和蛋白計量的統計表達均采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR

2 結果

2.1 miRNA-34c在宮頸癌組織和癌旁正常組織的表達采用qRT-PCR法檢測miRNA-34c在34例宮頸癌及癌旁正常組織中的表達，以U6作為對照。結果顯示，與癌旁正常組織相比，宮頸癌患者組織中miR?NA-34c表達水平明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.01，圖1）。

圖1 miRNA-34c在宮頸癌及癌旁正常組織中的相對表達Figure 1 Relative expression of miRNA-34c in cervical cancer tissues and normal paraneoplastic tissues

2.2 miRNA-34c靶基因的預測

為進一步探討miRNA-34c在宮頸癌中的作用，本研究采用生物信息學軟件TargetScan、miRBase和miRDB預測miRNA-34c可能的靶基因，選取3個數據庫均預測得到的靶基因作為候選，結果發現與腫瘤密切相關的PLK4為miRNA-34c預測的靶基因。圖2中豎線連接部分顯示miRNA-34c的種子序列靶向PLK4的3'UTR區。

2.3 熒光素酶活性檢測

為驗證miRNA-34c是否能與PLK4的3'UTR區直接結合，將構建好的pmirGLO-PLK4載體分別與miRNA陰性對照和miRNA-34c模擬物共轉染到HEK293T細胞，48 h后收集并裂解細胞，檢測其熒光素酶活性。結果顯示，與miRNA陰性對照相比，轉染miRNA-34c模擬物的熒光素酶的活性明顯降低（P< 0.01，圖3），提示PLK4是miRNA-34c的靶基因。

圖2 miRNA-34c種子序列與靶基因PLK4的3'UTR結合位點Figure 2 Binding sites of miRNA-34c to PLK4 3'UTR

圖3 miRNA-34c模擬物抑制熒光素酶活性Figure 3 miRNA-34c mimics repress luciferase activity

2.4 SiHa細胞增殖檢測及PLK4的mRNA和蛋白表達

MTT法檢測顯示，轉染miRNA-34c模擬物后，Si?Ha細胞增殖能力明顯低于轉染miRNA陰性對照（P< 0.01，圖4A）。qRT-PCR結果顯示，與陰性對照相比，轉染miRNA-34c模擬物細胞中的PLK4 mRNA表達水平顯著降低（P<0.01，圖4B）。轉染miRNA-34c模擬物細胞中的PLK4蛋白表達也明顯低于陰性對照（圖4C、D）。以上結果表明在SiHa細胞中miRNA-34c可能通過下調PLK4表達來影響細胞增殖。

圖4 SiHa細胞中PLK4 mRNA和蛋白表達Figure 4 Relative mRNA and protein expression levels of PLK4 in SiHa cells

3 討論

miRNA通過與靶基因mRNA的3'UTR結合，誘導靶基因mRNA降解或阻遏其轉錄后翻譯，從而在轉錄后水平調控基因的表達，miRNA通過作用于多個靶基因調控不同的生物學過程，如細胞發育、分化、增殖、凋亡［9］。某些特異性miRNA可作為腫瘤標志物，有利于腫瘤的臨床診斷、治療及預后分析。研究發現宮頸癌組織及細胞株中許多miRNA異常表達［10］，但相關致病機制目前仍不清楚。

miRNA-34c在多種腫瘤中表達下調，Liu等［11］證實miRNA-34c在非小細胞肺癌中表達下調，miRNA-34c通過靶向調節eIF4E表達抑制小細胞肺癌的細胞生長。Hagman等［5］發現抑制miRNA-34c表達能促進前列腺癌細胞的生長，而過表達miRNA-34c前列腺癌細胞中其侵襲能力明顯減弱。最近，Re等［12］證實miRNA-34c在喉鱗狀細胞癌組織中低表達，增加患者腫瘤的復發風險。同樣，本研究證實了miRNA-34c在宮頸癌組織中的表達下調，通過生物信息學預測了其新的靶基因PLK4；通過熒光素酶活性檢測證實了miRNA-34c可直接與靶基因PLK4的3'UTR區結合；轉染miRNA-34c模擬物能顯著下調SiHa細胞中PLK4 mRNA和蛋白質的表達，影響細胞增殖。因此，本研究證實了PLK4是miRNA-34c的靶基因，為宮頸癌的發生或發展機制研究提供了新的線索。

PLK4是一種廣泛存在于哺乳動物、高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于Polo-like激酶家族的成員［13］。PLK4在正常的非分裂期細胞中幾乎不表達，而在正常的處于分裂期的細胞中，PLK4的表達顯著升高。由于腫瘤細胞是一類增殖/分裂處于失控狀態的細胞，因此PLK4在人類多種腫瘤細胞中呈過表達，包括胃癌、結直腸癌、乳腺癌等［14］。研究顯示，PLK4過表達使中心粒過度復制，引起細胞的異常分裂，促進腫瘤發生及發展［15］。這些研究表明PLK4是一個非常有潛力的腫瘤治療靶標。miRBase數據庫顯示miRNA-34c可調節數百個靶基因，而每個靶基因可能發揮不同的生物學功能，本研究僅選擇了與宮頸癌發生相關的基因PLK4作為miRNA-34c的候選靶基因，將為闡明miRNA-34c在宮頸癌發生中的作用機制提供有力的證據。

綜上所述，本研究明確了miRNA-34c與宮頸癌的相關性，鑒定了PLK4為miRNA-34c的靶基因，為進一步研究宮頸癌發生或發展機制提供了新的線索。

[1] Ji CS.Relationship between pathology for early cervical cancer of lymphatic metastasis and its clinic[J].Chin Prac Med,2015,10(2): 76-77.[紀常生.早期宮頸癌微淋巴轉移病理與臨床的關系[J].中國實用醫藥,2015,10(2):76-77.]

[2] Burzawa J,Gonzales N,Frumovitz M.Challenges in the diagnosis and management of cervical neuroendocrine carcinoma[J].Expert Rev Anticancer Ther,2015,15(7):805-810.

[3] Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory func?tions[J].Cell,2009,136(2):215-233.

[4] Iorio MV,Croce CM.MicroRNAs in cancer:small molecules with a huge impact[J].J Clin Oncol,2009,27(34):5848-5856.

[5] Hagman Z,Larne O,Edsj? A,et al.miR-34c is downregulated in prostate cancer and exerts tumor suppressive functions[J].Int J Cancer,2010,127(12):2768-2776.

[6] Landgraf P,Rusu M,Sheridan R,et al.A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing[J].Cell, 2007,129(7):1401-1414.

[7] Cannell IG,Kong YW,Johnston SJ,et al.p38 MAPK/MK2-me?diated induction of miR-34c following DNA damage prevents Myc-dependent DNA replication[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(12):5375-5380.

[8] Luan S,Sun L,Huang F.MicroRNA-34a:a novel tumor sup?pressor in p53-mutant glioma cell line U251[J].Arch Med Res, 2010,41(2):67-74.

[9] Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory func?tions[J].Cell,2009,136(2):215-233.

[10]Iorio MV,Croce CM.MicroRNAs in cancer:small molecules with a huge impact[J].J Clin Oncol,2009,27(34):5848-5856.

[11]Liu F,Wang X,Li J,et al.miR-34c-3p functions as a tumour suppressor by inhibiting eIF4E expression in non-small cell lung cancer[J].Cell Prolif,2015,48(5):582-592.

[12]Re M,?eka A,Rubini CL,et al.MicroRNA-34c-5p is related to recurrence in laryngeal squamous cell carcinoma[J].Laryngoscope, 2015,125(9):E306-312.

[13]Kleylein-Sohn J,Westendorf J,Le Clech M,et al.Plk4-induced centriole biogenesis in human cells[J].Dev Cell,2007,13(2):190-202.

[14]Shinmura K,Kurabe N,Goto M,et al.PLK4 overexpression and its effect on centrosome regulation and chromosome stability in human gastric cancer[J].Mol Biol Rep,2014,41(10):6635-6644.

[15]Marina M,Saavedra HI.Nek2 and Plk4:prognostic markers,driv?ers of breast tumorigenesis and drug resistance[J].Front Biosci (Landmark ED),2014,19:352-365.

（2015-09-17收稿）

（2015-11-10修回）

Analysis of miRNA-34c expression in cervical cancer tissue and preliminary identification of Polo-like kinase 4 as its target gene

Honghong ZHANG,Xiaoli LIU,Sijuan XU

Department of Obstetrics and Gynecology,Intensive Care Unit,Gansu Provincial Maternity and Child Health Hospital,Lanzhou 730050,China

Objective:To analyze the expression profile of miRNA-34c in cervical cancer tissue and identify its novel target gene. Methods:The expression levels of miRNA-34c were detected in 34 paired cervical cancer tissues and normal paraneoplastic tissues via quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR).Polo-like kinase 4(PLK4)is a target gene of miRNA-34c predicted in the miRNA Target Database.Luciferase vector containing the binding site of miRNA-34c to PLK4 3'UTR and miRNA-34c mimic or negative control were co-transfected into HEK293T cells,and luciferase expression was examined.The miRNA-34c mimic or negative control was transfected into SiHa cells,and the mRNA or protein expression of PLK4 was detected via qRT-PCR or Western blot,respectively.Results:MiRNA-34c expression was lower in cervical cancer tissues than in normal paraneoplastic tissues.The miRNA-34c mimics significantly inhibited luciferase activation in the HEK293T cells(P<0.01)and significantly decreased the mRNA and protein expression levels of PLK4 in the SiHa cells(P<0.01).Conclusion:MiRNA-34c is significantly decreased in cervical cancer tissues.Moreover,miRNA-34c can significantly repress the mRNAand protein expression levels of PLK4 by directly targeting the 3'UTR.

miRNA-34c,PLK4,cervical cancer

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.22.028

甘肅省婦幼保健醫院婦產科重癥救護中心（蘭州市730050）

張紅紅 zhhzyzhh@sina.cn

張紅紅 專業方向為婦科腫瘤研究與診治。

E-mail：zhhzyzhh@sina.cn