CtBP2在食管鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義*

管程齊 肖明兵 陸翠華 倪溫慨 江楓 倪潤洲

·臨床研究與應用·

CtBP2在食管鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義*

管程齊 肖明兵 陸翠華 倪溫慨 江楓 倪潤洲

目的：研究羧基末端結合蛋白2（C-terminal binding protein 2，CtBP2）在食管鱗狀細胞癌組織中的表達情況及其與食管癌發生發展的關系。方法：Western blot法檢測8對食管鱗狀細胞癌新鮮冰凍組織、免疫組化法檢測90例食管鱗狀細胞癌石蠟切片組織中CtBP2表達情況，結合臨床病理和隨訪資料分析CtBP2表達與患者臨床病理參數及總生存率的關系。結果：兩法檢測結果均顯示CtBP2食管鱗狀細胞癌組織中的表達明顯高于對應的癌旁組織，且CtBP2的表達水平與食管癌的組織學分級（P= 0.002）、浸潤深度（P=0.032）相關，而與年齡、性別等參數無相關性。Kaplan-Meier分析結果顯示，CtBP2高表達組患者的總體生存率明顯低于CtBP2低表達組患者。結論：CtBP2在食管鱗狀細胞癌組織中表達顯著上調，提示其可能與食管鱗狀細胞癌的發生發展相關。

食管鱗狀細胞癌 CtBP2 轉錄因子 免疫組化

食管鱗狀細胞癌（以下簡稱食管癌）是全球發病率和死亡率較高的惡性腫瘤，其5年生存率小于30%。其發生與亞硝胺的慢性刺激、飲水、糧食蔬菜中微量元素的含量、炎癥與創傷以及遺傳因素有關［1］。轉錄因子因其存在的廣泛性和調控的多樣性，與腫瘤細胞的增殖、凋亡、浸潤轉移以及血管生成等各環節密切相關［2］。羧基末端結合蛋白（C-terminal bind?ing protein，CtBP）是進化上保守的轉錄抑制因子，是DNA結合蛋白與轉錄抑制酶之間的橋梁，能與一些DNA或蛋白質特異性結合，從而抑制基因的轉錄［3］。CtBP2是蛋白家族中的一員，作為短距離的轉錄抑制物的功能被研究得最多，然而，其作用的具體機制至今不清楚［4］。目前國內外對于CtBP2與食管癌的相關性研究較少。本研究旨在檢測CtBP2在食管癌組織中的表達，探討其表達水平與患者的臨床病理參數及預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

90例食管癌患者的石蠟組織標本，收集自2000年1月至2004年12月就診于南通大學附屬醫院胸外科實施手術的患者，其中男性63例，女性27例，年齡31～80歲，平均年齡61歲。所有患者術前均未行化療或放療，均有完整的臨床病理資料。8例配對的新鮮食管癌及癌旁組織標本于手術取材后立即置于-70℃冰箱內保存，用于后續實驗。本研究通過南通大學附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 Western blot實驗 用蛋白裂解液提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，將制備好的蛋白加入2× SDS上樣緩沖液，沸水浴15 min蛋白變性，取等量待測蛋白樣品及蛋白marker上樣，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉至PVDF膜，將轉印膜浸入含5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2 h，分別將稀釋后的CtBP2（1:200）、β-actin（1:50）的一抗浸潤轉印膜，4℃孵育過夜，TBST洗膜后浸潤于HRP標記的二抗中室溫孵育2 h，再次洗膜后使用ECL方法進行顯影，曝光，膠片晾干后，掃描并分析其灰度。將目的蛋白與內參灰度進行對比，所得的比值即為目的蛋白的相對表達量。

1.2.2 免疫組化染色 所有石蠟組織標本常規烤片、脫蠟、水化，加入檸檬酸鈉緩沖液抗原修復，用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，4%脫脂牛奶封閉30 min，1:100稀釋的CtBP2鼠抗人單克隆抗體（美國BD公司）室溫孵育2 h，用PBS洗滌，滴加HRP標記的山羊抗鼠IgG（美國Sigma公司）室溫孵育30 min，PBS充分洗滌后使用DAB顯色，流水沖洗后用蘇木素復染，酒精、二甲苯脫水，最后封片鏡檢。未加一抗者為陰性對照。

1.2.3 CtBP2陽性判定標準 因CtBP2系細胞核表達，故免疫組化陽性信號以細胞核內出現棕黃色染色為陽性細胞。在光學顯微鏡200倍的視野下，對每張切片具有代表性的腫瘤區域隨機選擇5個視野，染色結果采用半定量積分法判斷，即根據染色強度及陽性細胞分布比例進行評分。染色強度評分定義為：0（陰性）、1分（弱陽性）、2分（陽性）、3分（強陽性）。陽性細胞百分比評分定義為：1（<10%）、2（11～50%）、3（51～80%）、4（>80%）。以染色強度得分×陽性細胞百分比得分為最終染色評分，0～4分為低表達，>4分為高表達［5］。

1.3 統計學處理

采用SPSS 18.0統計分析軟件對實驗數據進行分析。CtBP2在食管癌中的表達和相應臨床病理學特征之間的關系采用χ2檢驗、Fisher精確概率法分析。用Kaplan-Meier法描繪患者生存曲線。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CtBP2在人食管鱗狀細胞癌及癌旁組織中的表達Western blot結果顯示：CtBP2在食管鱗狀細胞癌中的表達明顯高于對應癌旁食管組織。食管癌組織中均可檢測到CtBP2的表達，對應的癌旁組織中低表達或缺失表達，增殖指標PCNA作為陽性對照（圖1）。

圖1 CtBP2蛋白在食管鱗狀細胞癌及配對癌旁組織中的表達Figure 1 CtBP2 expression in human ESCC and paired adjacent normal tissues

2.2 CtBP2在人食管鱗狀細胞癌及癌旁石蠟切片組織中的表達

免疫組化結果表明：癌旁組織中低表達或缺失表達（圖2A）。CtBP2在食管癌中高表達，主要表達定位于細胞核，染色呈棕黃或棕褐色（圖2B）。

圖2 CtBP2在食管鱗狀細胞癌及癌旁組織中的表達（S-P×200）Figure 2 Immunohistochemical analysis of CtBP2 expression in human ESCC and paired adjacent normal tissues(S-P×200)

2.3 CtBP2的表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理因素的相關性

將統計數據分為高表達組和低表達組。通過兩組的對比結果分析顯示CtBP2的表達強度與食管癌患者的腫瘤組織學分級（P=0.002）、浸潤深度（P= 0.032）相關，而與患者的年齡、性別、腫瘤大小、有無淋巴結轉移、臨床分期無相關性（表1）。

表1 食管鱗狀細胞癌中CtBP2表達水平與臨床病理參數的關系Table 1 CtBP2 expression and clinicopathological parameters in 90 ES?CC specimens

2.4 CtBP2在食管鱗狀細胞癌中總體生存率的評價

將CtBP2按高、低表達分組，使用Kaplan-Meier法分析患者總體生存情況。CtBP2高表達的患者5年生存率顯著降低（圖3）。

圖3 CtBP2的表達與患者總體生存率的關系Figure 3 Association between GtBP2 expression and patient survival

3 討論

現今對于食管癌患者主要采用手術治療輔以放療、化療等綜合治療手段，但其臨床治療效果及遠期預后仍不理想，復發率及病死率較高［1］。目前對食管癌分子機制的研究表明其發生發展與多種癌基因過度表達以及腫瘤抑制基因的失活密切相關，是涉及多種致癌基因改變的復雜病理過程，這些基因通過各種信號轉導通路調節細胞增殖、細胞周期控制、細胞凋亡［6］。而轉錄水平的調控是基因發揮功能的一個重要過程。針對轉錄因子的活化與抑制，可以從不同環節尋找藥物作用靶點，從而來預防與轉錄因子調控相關的腫瘤疾病［2］。在研究與E1A C末端結合并下調癌基因轉錄的細胞蛋白時，人們發現了Ct?BP家族，CtBP蛋白家族是脊椎動物和非脊椎動物正常發育過程中必不可少的，并且該家族是進化中保持了高度保守性的轉錄抑制因子，它們和DNA結合的轉錄因子協作來調節靶基因的表達而參與細胞生物學行為，在細胞核內作為轉錄輔抑制因子起作用，而在細胞質內則控制膜轉運［7］。作為轉錄輔阻遏物，在轉錄調控過程中，CtBP能夠與多種識別并結合特異性DNA序列的轉錄因子形成轉錄復合物，募集各種染色體修飾酶，最終抑制與胚胎發育、細胞分化和分裂、腫瘤發生相關的基因轉錄［3］。早期研究發現在原代成纖維細胞中CtBP可通過抑制腫瘤抑制因子轉錄而調控細胞的衰老和再生，證實CtBP既是腫瘤抑制因子p16INK4A［8］、E-cadherin以及PTEN［9］的負性調節子，又是腫瘤抑制因子INK4A/Arf［10］、APC［11］、HIPK2［12］導致細胞凋亡的下調靶點。近年來越來越多的研究表明CtBP家族在各種腫瘤發生、發展中起到重要作用，如乳腺癌、結腸癌、子宮內膜癌等［13］。

由于差異性RNA剪接、翻譯后修飾，CtBP家族存在多個亞型，且各個亞型以時間和空間上的差異化模式進行表達，表現出各亞型存在功能特異性。CtBP1-L和CtBP2具有輔抑制因子活性，而CtBP1-S可能參與高爾基體膜分裂，RIBEYE可能具有在中樞神經系統中形成突觸的功能［3］。其中CtBP2是家族重要成員之一，定位在染色體21q21.3上，它有一個高度保守的功能區域，其N端的20個氨基酸對于其定位和活性非常重要，可特異性識別并結合含PX?DLS（-Pro-X-ASP-Leu-Ser-，X常是亮氨酸或纈氨酸）序列的相互作用蛋白。其C端形成一個具有與NAD+和NADH結合位點的單獨結構域，可使兩CtBP單體相互作用形成均聚物或異源多聚物［9］。CtBP2在胚胎發育、脂肪形成、血管生成方面均發揮重要作用［3］，而近年來很多研究發現CtBP2與腫瘤關系密切［10］。研究表明在結腸癌中CtBP2與TCF-4相互作用激活其轉錄活性引起下游靶基因β-catenin的激活導致細胞的遷移［15］。在乳腺癌中CtBP2通過調節E-candi?herin的轉錄促進腫瘤細胞遷移［16］。在肺癌細胞中過表達CtBP2引起靶基因PTEN去磷酸化，促使細胞增殖能力增強［17］。在前列腺癌中CtBP2通過激活c-Myc信號通路促進細胞增殖［18］。在本研究中采用免疫組化方法發現CtBP2在食管鱗狀細胞癌中顯著高表達，并且主要定位于細胞核中，8對新鮮食管癌及癌旁組織的蛋白質電泳結果也顯示CtBP2在癌組織中的表達顯著高于癌旁組織。對CtBP2臨床病理因素分析表明其與組織學分級及浸潤深度差異有統計學意義。Kaplan-Meier分析結果顯示，CtBP2高表達組患者的總體生存率顯著下降。以上結果提示CtBP2高表達與食管癌的惡性分化程度密切相關，作為獨立預后因子可能參與了食管癌的發生發展過程。

綜上所述，本研究發現CtBP2蛋白的表達水平與腫瘤組織學分級、浸潤深度、患者總體生存率顯著相關，是食管鱗狀細胞癌的分子標記物之一，也提示CtBP2可能是潛在腫瘤基因治療一個新的靶點，然而，CtBP2導致食管癌變過程的具體生物學機制還需進一步研究。

[1] Pennathur A,Gibson MK,Jobe BA,et al.Oesophageal carcinoma [J].Lancet,2013,381(9864):400-412.

[2] Wong MM,Guo C,Zhang J.Nuclear receptor corepressor com?plexes in cancer:mechanism,function and regulation[J].Am J Clin Exp Urol,2014,2(3):169-187.

[3] Stankiewicz TR,Gray JJ,Winter AN,et al.C-terminal binding proteins:central players in development and disease[J].Biomol Concepts,2014,5(6):489-511.

[4] Zhao LJ,Subramanian T,Vijayalingam S,et al.CtBP2 proteome: Role of CtBP in E2F7-mediated repression and cell proliferation [J].Genes Cancer,2014,5(1-2):31-40.

[5] Liu LK,Jiang XY,Zhou XX,et al.Upregulation of vimentin and aberrant expression of E-cadherin/beta-catenin complex in oral squamous cell carcinomas:correlation with the clinicopathologi?cal features and patient outcome[J].Mod Pathol,2010,23(2):213-224.

[6] Rustgi AK,El-Serag HB.Esophageal carcinoma[J].N Engl J Med,2014,371(26):2499-509.

[7] Cohen MJ,Yousef AF,Massimi P,et al.Dissection of the C-terminal region of E1Aredefines the roles of CtBP and other cellular targets in oncogenic transformation[J].J Virol,2013,87(18):10348-10355.

[8] Mroz Edmund A,Baird Abigail H,Michaud William A,et al. COOH-terminal binding protein regulates expression of the p 16 INK 4 A tumor suppressor and senescence in primary human cells [J].Cancer research,2008,68(15):6049-6053

[9] Paliwal S,Ho N,Parker D,et al.CtBP2 Promotes Human Can?cer Cell Migration by Transcriptional Activation of Tiam1[J]. Genes Cancer,2012,3(7-8):481-490.

[10]Chen YW,Paliwal S,Draheim K,et al.p19Arf inhibits the inva?sion of hepatocellular carcinoma cells by binding to C-terminal binding protein[J].Cancer Res,2008,68(2):476-482.

[11]Schneikert J,Brauburger K,Behrens J.APC mutations in colorec?tal tumours from FAP patients are selected for CtBP-mediated oligomerization of truncated APC[J].Hum Mol Genet,2011,20 (18):3554-3564.

[12]Hofmann TG,Glas C,Bitomsky N.HIPK2:A tumour suppressor that controls DNA damage-induced cell fate and cytokinesis[J]. Bioessays,2013,35(1):55-64.

[13]Straza MW,Paliwal S,Kovi RC,et al.Therapeutic targeting of C-terminal binding protein in human cancer[J].Cell Cycle,2010,9 (18):3740-3750.

[14]Chinnadurai G.The transcriptional corepressor CtBP:a foe of multiple tumor suppressors[J].Cancer research,2009,69(3):731-734.

[15]Patel J,Baranwal S,Love IM,et al.Inhibition of C-terminal bind?ing protein attenuates transcription factor 4 signaling to selective?ly target colon cancer stem cells[J].Cell cycle,2014,13(22):3506-3518.

[16]Paliwal S,Ho N,Parker D,et al.CtBP2 Promotes Human Cancer CellMigration by TranscriptionalActivation ofTiam1[J]. Genes&cancer,2012,3(7-8):481-490.

[17]Paliwal S,Kovi RC,Nath B,et al.The alternative reading frame tumor suppressor antagonizes hypoxia-induced cancer cell migra?tion via interaction with the COOH-terminal binding protein co?repressor[J].Cancer research,2007,67(19):9322-9329.

[18]Zhang C,Gao C,Xu Y,et al.CtBP2 could promote prostate can?cer cell proliferation through c-Myc signaling[J].Gene,2014,546 (1):73-79.

（2015-09-10收稿）

（2015-10-10修回）

（編輯：周曉穎）

Expression and clinical significance of CtBP2 in human esophageal squamous cell carcinoma

Chengqi GUAN,Mingbing XIAO,Cuihua LU,Wenkai NI,Feng JIANG,Runzhou NI

Department of Gastroenterology,theAffiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001,China
This work was supported by grants from the Youth Science Fund Project of the National Natural Science Foundation of China(No. 81502005)and Nantong Science and Technology Project(No.HS2014038 and HS2014072)

Objective:To explore the expression of C-terminal binding protein 2(CtBP2)in human esophageal carcinoma and its relationship with clinicopathological parameters and survival.Methods:The expression levels of CtBP2 in eight cases of fresh frozen specimens of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)and the adjacent esophageal tissues were detected by Western blot.Immunohistochemistry was used to detect CtBP2 expression in 90 samples of ESCC tissues and adjacent non-tumor tissues.Based on patient information and follow-up data,the correlation of CtBP2 expression with patients'clinicopathological characteristics and overall survival was further evaluated using Fisher's exact test and Kaplan-Meier method,respectively.Results:Immunohistochemistry and Western blot analysis showed that CtBP2 expression in tumor tissues was higher than that in adjacent non-tumor tissues.CtBP2 expression was significantly correlated with histologic grade(P=0.002)and depth(P=0.032).Kaplan-Meier analysis demonstrated that high CtBP2 expression was correlated with a short survival time.Conclusion:CtBP2 expression was upregulated in ESCC tissues,indicating that it may play a role in the oncogenesis and development of ESCC.

esophageal squamous cell carcinoma,CtBP2,transcription factor,immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.22.005

南通大學附屬醫院消化內科（江蘇省南通市226001）

*本文課題受國家青年科學基金項目（編號：81502005）和南通市科技計劃項目（編號：HS2014038、HS2014072）資助

倪潤洲 nirz@163.com

管程齊 專業方向為消化道腫瘤的分子生物學研究。

E-mail：gcq2005@aliyun.com