大腸桿菌O157：H7量子點免疫層析試紙條的研制

袁列江 李萌立 王書源 楊夢昕 李忠海

（1.湖南產商品質量監督檢驗檢疫局，湖南 長沙 410007；2.中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004）

在中國的食品中毒事件中，約一半由微生物引起，其中又以大腸桿菌引起的最多［1－4］。大腸桿菌 O157：H7型（Escherichia coliO157：H7）是一種腸道出血性大腸桿菌，是主要食源致病菌之一［5］。大腸桿菌O157：H7的致病性極強，有文獻［6］報道僅需100～200個細菌即可對人體產生中毒反應。大腸桿菌O157：H7在全球頻繁發生，傳播范圍廣，致病性強，往往一爆發就會造成嚴重危害，因此引起了各國政府的普遍關注。2011年腸出血性大腸桿菌菌株（EHEC）在歐洲的傳播非常迅猛，有13個國家的2 400多人被感染，其中23人死亡［7］。中國也爆發過多次，1999年發生的大腸桿菌O157：H7中毒事件，對中國的經濟造成了巨大損失［8］。

傳統的大腸桿菌檢測方法為平板培養法，試驗條件要求簡單，但操作繁瑣，檢測周期較長。分子生物學方法靈敏度高，但在實際應用中受試驗儀器的制約［9－13］。免疫層析技術［14］是近年發展的一種快速檢測方法，其檢測簡單迅速，每個樣品檢測時間在5min，方便快捷、特異靈敏、穩定性強、不需要設備支撐，是一種優良的快速檢測技術。解泉源等［15］以熒光微球為標記物建立了大腸桿菌O157：H7熒光微球免疫層析試紙條，不借助檢測儀器條件下檢測限可達1.2×104CFU/mL。王靜等［16］以膠體金做標記物，建立了大腸桿菌O157膠體金免疫層析快速篩查方法，檢測能在15min內完成，檢測限為1×105CFU/mL。

量子點（quantum dots，QDs）是一種由Ⅱ～Ⅵ族元素或Ⅲ～V族元素組成，直徑在1～10nm的半導體熒光納米粒子［17，18］。量子點中電子的能量狀態與原子相似，由于電子和空穴被量子限域，連續的能帶結構變成具有分子特性的分立能級結構，所以量子點受激后可以發射熒光。量子點顯示出了優良的熒光特性，量子點熒光強度和穩定性好，分別是傳統熒光染料的1 000倍和100倍，幾乎不受環境的影響，抗光漂白性強，可以反復激發，有利于長時間的試驗觀察。蔡朝霞等［19］利用化學偶聯劑使得量子點表面基團與菌體之間的成功結合，建立了一種快速簡便的大腸桿菌定量檢測分析方法，但此法幾乎沒有特異性。王玉嬌等［20］利用量子點甘露糖與大腸桿菌表面含有的FimH凝集素的特有識別性質，通過配體交換合成甘露糖修飾的量子點，作為檢測大腸桿菌的熒光探針，但此法針對大腸桿菌的特異性識別程度不如大腸桿菌抗原抗體反應。Wu等［21］利用兔抗山羊抗體交聯水溶性ZnS/CdSe量子點，合成了量子點熒光免疫探針，其方便性和特異性佳，應用廣泛。在免疫層析技術中，相比于其他標記物，以量子點為標記物，由于其基于熒光顯色，抗干擾性和檢測靈敏度理論上都更強。結合量子點的優良熒光性質和抗原抗體反應的特異性，本研究擬應用雙抗體夾心量子點免疫層析法檢測大腸桿菌O157：H7，并評價該方法的靈敏度、特異性、和適用性。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

分析天平：FA1004B型，上海佑科儀器儀表有限公司；

磁力攪拌加熱器：CJJ79－1型，金壇大地自動化儀器廠；

超純水機：ZWL－LS1－10型，湖南中沃水務環保科技有限公司；

熒光分光光度計：F96pro型，上海棱光儀器有限公司；

結合墊 Gl0194、層析膜Immunopore RP、PVC底板DB－4、吸水紙H5076：上海杰一生物科技有限公司；

Te粉、巰基乙酸、硼氫化鈉、氯化鎘：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

大腸桿菌 ATCC8739、鼠抗E.coli0157單克隆抗體（LM－Mab－01）、兔抗鼠IgG抗體：上海慧耘生物科技公司；

沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌：均為本實驗室保藏。

1.2 細菌培養

各種細菌采用LB固體培養基上劃線培養24h，挑選特征菌落接種與液體LB培養基培養24h。以生理鹽水梯度稀釋進行菌落計數。

1.3 免疫層析試紙條的制備

1.3.1 量子點制備 采用巰基乙酸作為修飾劑制備水溶性量子點。稱取31.9mg Te粉和28.4mg NaBH4至預先通氮除氧的圓底燒瓶中，加5mL除氧水，磁力攪拌至Te粉完全溶解，生成NaHTe溶液；稱取114.2mg的CdCl2·2.5H2O，加入250mL去氧水溶解；用移液槍量取混合修飾劑93μL，加入氯化鉻溶液中，滴加NaOH調節pH至9，使白色絮狀沉淀完全溶解；將溶液轉移至三口燒瓶中，通氮氣除氧，加入NaHTe溶液，100℃下加熱回流2h，得量子點溶液。透析純化后4℃冷藏。

1.3.2 大腸桿菌O157：H7與量子點偶聯最佳pH的確定

圖1 抗體與量子點偶聯原理圖Figure 1 Outline of antibody and quantum dot coupling

采用靜電結合的方法偶聯抗體蛋白和量子點（圖1）。移液槍取20μL純化過的量子點，0.1mol/L磷酸緩沖液分別調節pH 至6.2，6.7，7.2，7.7，8.2。分別向其中加入20μL兔大腸桿菌抗體EC－MAB－01，在37℃條件下，150r/min震動反應2h，后置于冰箱中4℃過夜。為純化反應量子點大腸桿菌抗體混合物，將混合物用40 000r/min超速離心，去上清液，將沉淀用BSA溶液重懸，相同條件下離心兩次，重懸得到大腸桿菌量子點熒光偶聯物。采用免疫層析法確定偶聯效果［22］。

1.3.3 免疫層析試紙條組裝 免疫層析試紙由樣品墊、結合墊、層析膜、吸水紙和底板構成。樣品墊和結合墊采用BSA溶液浸泡后洗滌干燥，以減少實際檢測時的蛋白吸附。將免疫化量子點加入結合墊中，干燥。層析膜檢測帶和質控帶為鼠抗E.coli0157單克隆抗體（LM－Mab－01）劃線。將樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙依次粘貼于底板上，切成3mm的試紙條，－20℃低溫保藏待用。

1.3.4 試紙條特異性的評價 將濃度在1×107CFU/mL的大腸桿菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、肉毒桿菌、黃色葡萄球菌各取0.5mL，以制備好的量子點熒光免疫層析試紙條檢測。

1.3.5 試紙條靈敏性評價 將大腸桿菌O157：H7菌懸液按10倍梯度稀釋制備的1×101～1×108CFU/mL大腸桿菌菌液分別滴加到試紙條加樣孔，待免疫反應達到平衡后，在紫外燈下觀察質控線和檢測線。

1.3.6 試紙條在食品樣品中檢測適用性評價 選取火腿腸為肉制品模擬物作檢驗對象。稱取1g火腿腸加4mL超純水搗碎，濾去火腿腸渣，將100μL大腸桿菌污染至0.9mL火腿腸濾液中，得到肉制品待測液。選取純牛奶為乳制品模擬物作檢測對象，將100μL大腸桿菌污染至0.9mL牛奶中，得到乳制品待測液。選取小白菜為蔬菜品模擬物作檢測對象，剪下表面積約5cm2的葉子加水4mL搗碎，濾去葉渣，將100μL大腸桿菌污染至0.9mL小白菜濾液中，得蔬菜待測液。3個樣品分別10倍梯度稀釋成菌濃度約1×105，1×104，1×103CFU/mL待測。各個待測樣取100μL的待測液體用量子點熒光免疫層析試紙樣品進行檢測。

2 結果與分析

2.1 量子點的透射電鏡及X衍射分析

將等體積比的異丙醇倒入CdTe量子點水溶液中，充分攪拌，沉淀，離心后，將得到的固體產品置于真空干燥箱中干燥得到CdTe量子點固體粉末。

如圖2所示，利用本試驗方法制備的CdTe量子點在水溶液中具有很好的分散性與穩定性，CdTe量子點呈近似球形，尺寸大約在5nm左右，分散均勻。X衍射如圖3所示，CdTe量子點結晶性良好，其晶型結構為閃鋅礦立方晶相。

圖2 CdTe量子點的TEM圖像Figure 2 TEM photography of CdTe QDs

圖3 CdTe量子點的X衍射圖譜Figure 3 XRD pattern of CdTe QDs

2.2 量子點與大腸桿菌抗體的偶聯效果

量子點的熒光發射光譜顯示，550～700nm為熒光發射峰波段，發射峰為620nm，半峰寬為75nm，熒光發射峰對稱性好。CdTe量子點在與大腸桿菌抗體偶聯之后，最大熒光值及發射峰的半峰寬都沒有變化（見圖4），表明CdTe量子點與大腸桿菌O157：H7抗體偶聯之后，分散性保持良好，沒有聚團，其熒光性質保持穩定［23］。熒光發射峰位置紅移了2nm，引起發射峰位置移動的原因可能是，CdTe量子點在與蛋白質通過電荷相互作用的過程中，由于蛋白質大分子偶聯多個量子點，從而引起其偶極相互作用增加，斯托克斯位移增大，發射光譜紅移［24］。

圖4 量子點與大腸桿菌O157：H7抗體靜電偶聯前后熒光圖譜對比Figure 4 Comparison of fluorescence spectrum before and after electrostatic coupling

如圖5所示，在層析法驗證量子點與大腸桿菌抗體偶聯效果中，pH 6.7，7.2，7.7時出現了兩條明顯的熒光帶，其中7.2尤其清晰。說明靜電偶聯的辦法是可行的，偶聯之后能保持抗體的特異性，并且最佳偶聯pH值為7.2。大腸桿菌單克隆抗體是一種免疫球蛋白，其等電點為pI 8.0，在pH為8時，其不適用結合其他物質。在pH＜8時，免疫球蛋白帶正電荷。以巰基乙酸為穩定劑合成的量子點表面為巰基和羧基，且在堿性條件下合成，其表面帶負電。由于帶電性相反，兩者在溶液中容易發生靜電吸引從而產生偶聯。理論上來說，量子點與抗體之間的帶電差異越大偶聯越好，所以應在偏堿環境偶聯，具體在pH 7～8進行，這在試驗結果中得到驗證。綜上，量子點與大腸桿菌抗體靜電偶聯技能保持量子點的熒光性質也能保持抗體的特異性，是一種成功的偶聯方式。

圖5 不同pH值下量子點與大腸桿菌的偶聯效果Figure 5 Coupling effect observation of quantum dots in Escherichia coli under UV lamp

2.3 量子點免疫層析試紙條組裝

如圖6所示，量子免疫層析試中羊抗兔二抗為質控線，大腸桿菌抗體為檢測線，分別用劃膜儀固定在硝酸纖維膜上，結合墊采用量子點大腸桿菌抗體偶聯物浸潤，在37℃條件下經干燥后制得。將樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，按順序粘貼到PVC底板上，各部分重疊以保證樣品液體的流動。其檢測原理為雙抗體夾心法，在檢測過程中，樣品中的大腸桿菌在毛細作用下往吸水紙方向移動，結合墊中的量子點抗體偶聯物會標記到大腸桿菌上，在繼續往吸水紙方向移動的過程中，檢測線上的大腸桿菌抗體會將標記量子點的大腸桿菌捕獲，形成檢測帶，未標記大腸桿菌的量子點抗體偶聯物繼續移動至質控線被羊抗兔二抗捕獲形成質控線。

2.4 量子點免疫層析試紙特異性評價

圖6 量子點免疫層析試紙結構圖Figure 6 Structure of QDs immunochromatographic strip

用純凈水分別稀釋各種細菌至1×107CFU/mL，各取0.5mL滴加至量子點熒光免疫層析試紙上進行檢測，結果（圖7）表明，大腸桿菌O157：H7樣品呈陽性反應，其余樣品均為陰性反應，包括沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌。試驗顯示，大腸桿菌O157：H7量子點熒光免疫層析試紙條與其它細菌之間不發生反應，其特異性良好。

圖7 量子點免疫層析試紙特異性測試Figure 7 Specific test of QDs immunochromatographic strips

2.5 量子點免疫層析試紙靈敏度評價

大腸桿菌O157：H7最初源于出血性結腸炎病的人畜及感染此菌的人畜排泄物。在處理不到位的地區，這些排泄物通過一些方式，會釋放到水體，對水體造成污染。將大腸桿菌O157：H7樣品用自來水按照10倍梯度稀釋，通過傾注平板法測得其濃度分別約為1×108，1×107，1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×101CFU/mL。分別取100μL不同濃度的菌懸液用量子點熒光免疫層析試紙條檢測，結果最低的檢出濃度為1×104CFU/mL，同市售的大腸桿菌O157：H7膠體金免疫層析試紙檢測相比，其最低檢測濃度要低一個數量級，靈敏度更高（見圖8）。

圖8 兩種免疫層析試紙靈敏度測試對比Figure 8 Contrast of sensitivity testing of two kinds immunochromatographic strip

2.6 量子點免疫層析試紙適用性評價

受大腸桿菌的生物學性質影響，肉制品的生產加工過程中極易產生大腸桿菌污染事件［25，26］。牛、羊、豬等動物是大腸桿菌O157：H7的宿主，會由于肉制品本身攜帶、操作工人攜帶、不按規范操作導致產品污染［27］。乳制品中大腸桿菌污染也非常常見，同肉制品一樣，乳制品來源于動物，且主要為牛奶，其生產、加工、運輸、儲藏過程中也容易受大腸桿菌的污染［28］。蔬菜中的大腸桿菌污染主要來自農家肥的使用，清洗不凈會導致致病菌的殘留。此外，肉制品和乳制品能為大腸桿菌O157：H7的生長提供極佳的環境，因此容易造成其大規模富集。

實際的檢測結果（表1）表明，量子點熒光免疫層析試紙在實際樣品中適用性良好，在肉制品、乳制品和蔬菜樣品中靈敏性與在自來水中檢測相當。與膠體金試紙條相比，其靈敏度仍要高一個數量級。

表1 量子點熒光免疫層析試紙適用性測試Table 1 Applicability test of quantum dot fluorescent immune chromatography

量子點熒光免疫層析試紙保藏于－20℃的低溫冰箱中。分別在保藏1，3，5，10，20，30，40，50，60d時用試紙對大腸桿菌進行檢測。結果表明，60d內在－20℃條件下，量子點熒光免疫層析試紙中的抗體保持良好的活性，量子點熒光性質穩定，整個試紙的性質保持良好。

3 討論

大腸桿菌O157：H7是一個全球范圍的公共衛生問題，各國都將其列為必檢項目［29］。其各種檢測技術中，以免疫層析技術的檢測最為方便快捷，現最流行的為膠體金免疫層析技術。在檢測某些目標物質濃度較低的樣品時，膠體金本身的顏色太淺，無法使用肉眼進行判斷。量子點具有極佳的熒光性質，激發光譜寬，熒光強度高而且穩定，十分有利于降低免疫層析技術的檢測限。本試驗將大腸桿菌抗體與羊抗兔二抗劃線固定于層析膜，量子點大腸桿菌單克隆抗體偶聯物浸潤與結合墊干燥，通過構建免疫層析系統，完成了量子點大腸桿菌熒光免疫層析試紙。該法不僅結合了免疫反應與層析技術準確快速的優點，并且相比于膠體金試紙，由于量子點基于熒光顯色，因而其抗干擾性更強，檢測限更低。本研究構建的量子點試紙的特異性良好，最低檢測限為104CFU/mL，檢測時間小于5min，能適用于多種實際樣品的現場快速檢測。

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2 中國國家衛生部.衛生部關于2012年全國食物中毒事件報告情況的通 報 ［Z/OL］.衛 辦 應 急發 ［2013］4 號 （2013—03—04）［2013—07—20］.http：//www.moh.gov.cn/mohwsbwstjxxzx/s7967/201303/b70872682e614e4189d0631ae5527625.shtml.

3 中國國家衛生部.衛生部關于2013年全國食物中毒事件報告情況的通報［Z/OL］.衛辦應急發［2014］15號（2013—02—20）［2014—09—21］.http：//www.moh.gov.cn/yjb/s3585/201402/f54f16a4156a460790caa3e991c0abd5.shtml.

4 中國國家衛生部.衛生部關于2014年全國食物中毒事件報告情況的通 報 ［Z/OL］.衛 辦 應 急發 ［2015］9 號 （2015—02—15）［2015—03—12］.http：//www.moh.gov.cn/yjb/s3585/201502/91fa4b047e984d3a89c16194722ee9f2html.

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