裙帶菜孢子葉多糖的超聲輔助提取工藝優化及其抗氧化活性研究

董秀芳 李 楠 韓 冬 馮丁丁 傅 卉 焦 陽 熊 欣 啟 航（.大連工業大學食品學院，遼寧 大連 6034；2.國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 6034）

裙帶菜（Undaria pinnatifida）歸屬褐藻門，褐藻綱，海帶目，翅藻科，是一年生大型溫帶性的海洋藻類，主要分布在中國、日本和韓國的沿海地帶［1］，是中國重要的經濟型藻類之一，也是中國重要的出口水產品之一。2013年中國裙帶菜的產量達17.0萬t（干重）［2］，主要分布在遼寧、山東兩省。孢子葉作為裙帶菜根部，因其纖維含量較高，相對較硬，在加工中往往以廢料的形式扔棄［3］，造成了一定的資源浪費和環境污染。孢子葉富含蛋白質、多糖、維生素等營養成分［4］，其多糖又具有降血糖、降血脂、降血壓、抗凝血、抗病毒、抗腫瘤等生理功效［5］。因此采用合適的提取方法提取裙帶菜孢子葉中的多糖具有非常重要的意義。

目前，天然多糖的提取方法主要有熱水浸提法、酶輔助提取法、微波輔助提取法及超聲波輔助提取法等［6］。近幾年，裙帶菜孢子葉多糖的提取方法集中在熱水浸提法和酶輔助提取法［7－9］。熱水浸提法提取時間長、能耗高；而酶輔助提取法反應條件比較溫和，但成本較高。而超聲波輔助提取法是利用超聲波產生的能量使介質的結構發生空間變化，使有效成分能快速進入溶劑中。同時，超聲波產生的空化效應還可進一步破壞細胞結構，進而促進細胞內的有效成分直接溶于溶劑并充分混合，最終實現較高的提取效率［10，11］。因此，本研究擬利用超聲波技術來輔助提取裙帶菜孢子葉中的多糖，并采用響應面法（response surface method，RSM）設計對提取工藝進行優化，同時利用電子自旋共振技術檢測裙帶菜孢子葉多糖的抗氧化活性，以期為裙帶菜孢子葉的精深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裙帶菜孢子葉：大連水產養殖集團有限公司；

1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH）：優級純，美國Sigma公司；

二甲基吡咯啉氮氧化物（DMPO）：優級純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；

其他試劑：分析純，市售。

1.2 儀器設備

超聲波細胞破碎機：JY92－ⅡDN型，寧波新芝生物及科技股份有限公司；

電子順磁波譜儀：A200型，德國布魯克公司；

紫外可見光分光光度計：UV－5200型，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

裙帶菜孢子葉→干燥（60℃）→粉碎（過60目篩）→加入水浸泡（30min）→超聲波處理→恒溫提取→離心（4 000r/min，30min）→醇沉（上清液加入3倍體積的無水乙醇）→靜置（4℃靜置過夜）→離心（4 000r/min，25min）→粗多糖

1.3.2 多糖含量的測定 參照文獻［12］。

1.3.3 孢子葉多糖得率的計算 按式（1）進行。

式中：

R——孢子葉多糖的提取率，%；m1——多糖的質量，mg；

m2——孢子葉干粉的質量，mg。

1.3.4 單因素試驗 稱取裙帶菜孢子葉干粉，分別按照不同的提取時間、液料比、超聲功率、超聲時間進行處理，以多糖得率為評價指標，確定各因素的最佳取值范圍。考慮到節省能源、降低成本，并參考文獻［13］，設計提取在50℃條件下進行。各單因素試驗的設計：

（1）提取時間：固定液料比60∶1（V∶m），超聲功率300W，超聲時間4min，提取時間分別取1，2，3，4h。

（2）液料比：固定超聲功率200W，超聲時間4min，提取時間2h，液料比分別取60∶1，70∶1，80∶1，90∶1，100∶1（V∶m）。

（3）超聲功率：固定液料比80∶1（V∶m），超聲時間4min，提取時間2h，超聲功率分別取100，200，300，400，500W。

（4）超聲時間：固定液料比80∶1（V∶m），超聲功率300W，提取時間2h，超聲時間分別取2，3，4，6，8min。

1.3.5 響應面試驗 選取影響孢子葉多糖得率顯著的因素，以多糖得率為評價指標，采用中心組合試驗Box－Behnken設計方案，優化超聲波輔助提取裙帶菜孢子葉多糖的工藝條件。

1.3.6 孢子葉多糖的抗氧化活性研究

（1）對 DPPH·的清除作用：200μmol/L的 DPPH 200μL，pH 6.0、100mmol/L的磷酸鹽緩沖液200μL，各多糖濃度的樣液100μL，迅速混合，避光保存30min后，4 600r/mim離心10min［14］。然后立即將一定量的上清液吸入毛細管，放入諧振腔，進行測定。空白組用雙蒸水代替樣液，以波譜信號第3個峰高值表示信號的相對強度。

（2）對·OH的清除作用：按照Fenton反應建立·OH發生體系，包括10μL的6mmol/L EDTA－2Na—Fe2＋，8μL的6%H2O2，5μL的1mol/L DMPO，各多糖濃度的樣液39μL，加 150mmol/L、pH 7.4 的 磷 酸 鹽 緩 沖 液 補 至100μL，振蕩后40℃水浴30min，然后立即吸入毛細管，放入諧振腔，進行測定。空白組中提取液用雙蒸水代替，以波譜信號第2個峰高值表示信號的相對強度［15，16］。

式中：

R1——對自由基的清除率，%；

A0——空白組峰高；

A1——加樣后峰高。

1.3.7 數據分析 采用Excel 2007版軟件進行單因素試驗分析，Design－Expert 8.05軟件進行響應面試驗設計及分析，用SPSS 16.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間對多糖得率的影響 由圖1可知，隨著提取時間的延長，多糖得率呈現增加趨勢，但提取2h后，增加趨于平緩。考慮到提高效率等原則，確定提取時間2h為宜。

2.1.2 液料比對多糖得率的影響 由圖2可知，隨著液料比的增大，多糖得率呈現先增加后減少的趨勢，這與李建等［13］的研究結果相似。當液料比為90∶1（V∶m）時，多糖得率達到峰值。因此，選擇90∶1（V∶m）為宜。

圖1 提取時間對多糖得率的影響Figure 1 Effect of extraction time on polysaccharide yield

圖2 液料比對多糖得率的影響Figure 2 Effect of ratio of water to material on polysaccharide yield

2.1.3 超聲功率對多糖得率的影響 由圖3可知，隨著超聲功率的增大，多糖得率呈現先增加再較少的趨勢。當超聲功率為400W時，多糖得率達到峰值。因此，超聲功率選擇400W為宜。

圖3 超聲功率對多糖得率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic power on polysaccharide yield

2.1.4 超聲時間對多糖得率的影響 由圖4可知，隨著超聲時間的延長，多糖得率呈現先增加再減少的趨勢。當超聲時間為6min時，多糖得率達到峰值。當超聲時間超過一定范圍時，可能導致生物大分子在超聲波為自由基的氧化還原反應提供能量的情況下發生降解［17］。因此，超聲時間選擇6min為宜。

圖4 超聲時間對多糖得率的影響Figure 4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of polysaccharides

2.2 響應面分析法對裙帶菜孢子葉多糖提取工藝的優化

2.2.1 響應面試驗設計 根據單因素試驗結果，結合能耗因素，在50℃浸提2h條件下，選擇液料比、超聲功率和超聲時間3個因素為自變量，多糖得率為響應值Y。并根據Box－Behnken原理設計了三因素三水平，共計16個試驗點來確定提取的最佳工藝條件［18］。具體試驗方案與結果見表1及表2。

表1 響應面的因素與水平Table 1 Factors and levels of RSM

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experiment design and results of RSM

2.2.2 響應面分析 根據表2的試驗結果進行方差分析，結果見表3。由表3可知，模型極顯著，建模成功；超聲時間B和超聲功率C項顯著，平方項A2極顯著、B2顯著；液料比A、交互項和C2不顯著。擬失態P值為0.258 4，不顯著，表明擬失誤差相對于純誤差是不顯著的，有益于模型的建立。經回歸擬合后，得到式（3）：

對模型進行可信度分析，結果見表4。回歸方程的復相關系數R2＝0.966 4，說明此模型與實際試驗擬合較好。信噪比為11.556大于4，也說明了模型的可靠性。

表3 模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the model

表3 模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the model

＊＊表示P＜0.01，差異極顯著；＊表示P＜0.05，差異顯著。

來源 平方和 自由度 均方 F值 P 值 顯著性模型 3.42 9 0.38 19.15 0.000 9＊＊A 1.13×10－4 1 1.13×10－4 5.68×10－3 0.942 4 B 0.22 1 0.22 11.32 0.015 1 ＊C 0.13 1 0.13 6.43 0.044 3 ＊AB 4.23×10－3 1 4.23×10－3 0.21 0.660 6 AC 3.60×10－3 1 3.60×10－3 0.18 0.684 8 BC 0.011 1 0.011 0.56 0.484 0 A2 2.66 1 2.66 134.05 ＜0.000 1 ＊＊B2 0.29 1 0.29 14.44 0.009 0 ＊＊C2 0.10 1 0.10 5.17 0.063 4殘差 0.12 6 0.020擬失態 0.083 3 0.028 2.28 0.258 4純誤差 0.036 3 0.012總誤差3.54 15

表4 模型的可信度分析Table 4 The credibility analysis of the model

2.2.3 各因素交互作用對多糖得率的響應面分析 模型中各因素之間相互作用的效應圖，見圖5～7。3個圖均發生了彎曲，可以判斷3個單因素與提取率的關系都是非線性的；從等高線的形狀可以判斷兩兩交互作用均不顯著。

2.2.4 模型驗證實驗 軟件分析后得出的最佳提取條件為液料比89.91∶1（V∶m），超聲時間6.56min，超聲功率435.06W，多糖提取率預計可達到7.70%。考慮到實際操作的可行性，將工藝條件調整為液料比90∶1（V∶m），超聲時間6.5min，超聲功率440W，經過3次平行實驗，測定多糖得率為7.71%，與理論值相差較小。說明建立的模型能真實地反應液料比、超聲時間、超聲功率對孢子葉多糖得率的影響，該響應面模型具有可行性。本試驗的多糖得率明顯高于單純熱水浸提法（4.137%）［7］，說明超聲波輔助法有利于裙帶菜孢子葉多糖的提取。主要是因為裙帶菜孢子葉的細胞壁纖維含量較高，單純的熱水浸提很難將多糖從細胞中釋放出來，而超聲波對孢子葉細胞的機械破壞作用強烈，利于多糖析出。

2.3 裙帶菜孢子葉多糖的抗氧化測定

電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）可測定磁場中的未成對電子［19］，可實現快速有效地檢測自由基［20］，具有上樣量少、靈敏度高等特點。在天然化合物的抗氧化研究中，應用較為成熟。

圖5 液料比與超聲時間的交互作用Figure 5 Interaction of ratio of water to material and ultrasonic time

圖6 液料比與超聲功率的交互作用Figure 6 Interaction of ratio of water to material and ultrasonic power

圖7 超聲功率與超聲時間的交互作用Figure 7 Interaction of ultrasonic power and ultrasonic time

2.3.1 對DPPH·的清除作用 DPPH·作為一種含有不對稱價電子的氮族自由基，自由基清除劑促使其單電子配對，削弱ESR的信號強度（特征峰的峰高），進而可通過峰高的變化來表示對DPPH·的清除作用。本試驗通過ESR技術來檢測不同濃度的裙帶菜孢子葉粗多糖溶液對DPPH·的清除作用，結果見圖8。由圖8可知：裙帶菜孢子葉多糖對DPPH·具有一定的清除作用，并且隨著多糖濃度的升高，清除作用顯著增強（P＜0.05）。當多糖濃度為1mg/mL時，清除率可達（71.14±0.55）%左右，其對DPPH·的半抑制率IC50值為0.24mg/mL。該結果與何傳波等［19］報道的海帶多糖抗氧化活性IC50相似（0.20mg/mL）。

2.3.2 對·OH的清除作用 不同濃度的裙帶菜孢子葉粗多糖溶液對·OH的清除作用的ESR圖譜及清除率見圖9。DMPO可捕捉Fenton反應體系產生的·OH，形成比較穩定的加合物DMPO—OH，進而提高ESR檢測的靈敏度［21］。由圖9可知，通過ESR檢測到了加合物的特征峰型（峰高為1∶2∶2∶1），隨著多糖濃度的增加，ESR圖譜的峰高逐漸降低，清除能力顯著增強（P＜0.05）。其對·OH的半抑制率IC50為0.28mg/mL，與何傳波等［22］報道的結果（IC50為0.238mg/mL）相近。

圖8 粗多糖溶液對DPPH·的清除作用Figure 8 The scavenging effect of crude polysaccharide solution on DPPH·

圖9 粗多糖溶液對·OH的清除作用Figure 9 The scavenging effect of crude polysaccharide solution on·OH

3 結論

在單因素試驗的基礎上，通過響應面試驗確定了超聲波輔助提取裙帶菜孢子葉多糖在50℃提取2h時的最優工藝，即液料比90∶1（V∶m），超聲時間6.5min，超聲功率440W，此時多糖得率為7.71%。ESR試驗結果表明裙帶菜孢子葉多糖對DPPH·和·OH均有較強的清除作用，有望成為具有抗氧化功能的保健食品。下一步將對該多糖進行分離純化，以明確其結構，同時將開展體內試驗研究。

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