龍眼核提取物的體外抗氧化及抑菌活性研究

周 凱 胡卓炎 周沫霖 趙 雷（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

龍眼（Dimocarpus longan lour.）俗名桂圓，是無患子科龍眼屬植物，屬于典型的亞熱帶果樹，在中國主要分布于廣東、廣西、福建及臺灣一帶，海南、云南、四川和貴州等省也有栽培，產量居世界首位。龍眼核即龍眼的種仁，占果實鮮重約為17%（干品約75%），其性味澀、平，氣微，味淡而微苦，具有止血、定痛、理氣化濕、治創傷出血、疝氣等和治狐臭作用［1］。龍眼核的化學成分和藥理活性研究發現，其提取物中含有多糖、生物堿、黃酮和多酚類等活性物質［2－7］，具有良好的抗氧化［6，8］、抑菌及降血糖等生物活性［9－12］。目前龍眼加工基本以制成龍眼干、桂圓肉、龍眼果肉罐頭為主，龍眼核是加工過程中產生的主要廢棄物，每年廢棄的龍眼核高達幾十萬噸［13］。本研究以龍眼核為原料，通過95%乙醇提取，得到的粗提物用不同極性的有機溶劑萃取，經濃縮、干燥后研究各萃取物的抗氧化和抑菌活性，以期為龍眼核藥用植物資源的充分利用和合理開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍眼核：品種為石硤，購于廣州天河區長湴綜合市場；

無水乙醇、95%乙醇：分析純，天津富宇精細化工有限公司；

石油醚（沸程60～90℃）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、鄰苯三酚、抗壞血酸、沒食子酸等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

Folin－Ciocalteu：美國Sigma公司；

1，1－二苯基苦基苯肼（DPPH）：梯希愛化成工業有限公司；

ABTS試劑盒：碧云天生物技術有限公司；

供試菌種：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella typhimurium），由華南農業大學食品學院微生物實驗室提供。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計：uvmini－1240型，島津公司；

酶標儀：EnsPire型，珀金埃爾默企業管理（上海）有限公司；

真空冷凍干燥機：FD－1C型，北京博醫康實驗儀器有限公司；

離心機：TD5－II型，長沙平凡儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：RE－52A型，上海亞榮生化儀器廠；

人工氣候箱：LRH－250－GSB型，廣東省醫療器械廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 龍眼核粗提物及各萃取物的制備 將60℃下烘干至恒重的龍眼核粉碎至粉末狀，取粉末200g，加入95%乙醇1L，70℃下利用攪拌機攪拌，提取3次，每次3h；合并提取液，離心15min（3 500r/min），50℃減壓濃縮至無醇味的浸膏；浸膏加適量蒸餾水分散，用石油醚脫脂，氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇都與分散液體積比3∶1依次萃取，每種溶劑萃取4次，合并萃取液，50℃減壓濃縮、回收溶劑；除石油醚濃縮物外，其他不同極性的濃縮物在真空冷凍干燥機中干燥，得到其質量分別為氯仿萃取物0.69g，乙酸乙酯萃取物4.14g，正丁醇萃取物4.19g，剩余水層物5.51g。

1.3.2 菌懸液的制備 試驗前從保存菌種斜面上用接種環蘸取微量的菌苔，接種在MH肉湯培養基中，于37℃培養16～18h，取出作為原菌液，再用MH肉湯培養基或1%滅菌胨水把原菌液稀釋成菌液濃度為106～107CFU/mL的菌懸液。

1.3.3 總酚含量測定 參照文獻［14］的方法并稍作改進，取0.2mL樣品溶液于10mL容量瓶，加入5.8mL蒸餾水，搖勻，再加0.5mL福林酚溶液充分混勻30s，室溫下反應3～8min加入15%碳酸鈉溶液1.5mL，定容至10mL，在室溫下避光放置2h后在765nm下測定其吸光值，并以沒食子酸標準品制作標準曲線，得線性回歸方程y＝0.109 3x－0.035 3，線性范圍為0～0.1mg，相關系數R2為0.998 6。

1.3.4 體外抗氧化活性的測定

（1）ABTS＋自由基清除能力的測定：參照文獻［15］。萃取物清除ABTS＋自由基的能力與Trolox清除自由基的能力相對比。確定其相對抗氧化活性，單位為mmol/g，即每克萃取物樣品清除ABTS＋自由基能力相當于Trolox清除同等自由基能力的毫摩爾數。

（2）DPPH 自由基清除能力的測定：參照［16］、［17］。

（3）超氧陰離子自由基清除能力的測定：鄰苯三酚自氧化法［18－20］。

（4）羥自由基清除能力的測定：鄰二氮菲—Fe2＋氧化法［21－23］。

以水溶性維生素E（Trolox）和抗壞血酸為陽性對照，以上試驗平行樣均為3個，取平均值。

1.3.5 體外抑菌活性的測定 采用牛津杯法［24］。將配好的菌懸液用無菌棉簽蘸取菌液在管壁上擠去多余菌液，涂布整個平板表面，涂布均勻，制成含菌平板。用鑷子將滅菌后的牛津杯輕輕放入培養皿中，在水平放置的平皿中均勻地放置3只牛津杯（規格10mm×7.8mm×6mm），逐一加入各樣液150μL，以無菌水與95%乙醇作為陰性對照，質量濃度為1mg/mL的阿莫西林作為陽性對照。細菌37℃恒溫培養24h后，觀察抑菌情況，用直尺測量抑菌圈直徑，每個平板做3個平行樣，取平均值。

2 結果與分析

2.1 龍眼核粗提物不同極性部位的總酚含量

龍眼核粗提物依次用不同有機溶劑萃取得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及剩余水層物，以龍眼核粉末200g為總質量來計算，經真空冷凍干燥后各部分萃取物得率分別為0.35%，2.07%，2.10%，2.78%。采用Folin－Ciocalteu比色法測定龍眼核粗提物中各萃取物的總酚含量，結果見圖1，總酚含量由高到低為：乙酸乙酯層＞氯仿層＞正丁醇層＞剩余水層，其中乙酸乙酯層的總酚含量高達693.51mg/g。

2.2 龍眼核粗提物不同極性部位的抗氧化活性

圖1 龍眼核粗提物不同極性部位的總酚含量Figure 1 The total polyphenol contents in crude extract of different polarity parts of Longan seeds

2.2.1 清除ABTS·＋的能力 由圖2可知，隨著濃度上升，各物質對ABTS·＋的清除能力逐漸增大，測試樣品濃度與清除率呈一定的量效關系。當Trolox的摩爾濃度為0.9mmol/L時對 ABTS·＋的清除率達到平衡，清除率為94.00%，隨著濃度的增加，清除率緩慢增大，很快達到平衡。利用Origin 8.0進行曲線擬合，得到乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、剩余水層萃取物的IC50值分別為0.10，0.14，0.39，1.27mg/mL，Trolox的IC50值為0.35mmol/L，同時可估算出其總抗氧化能力分別為3.5，2.5，0.9，0.3mmol/g。龍眼核各萃取物對ABTS·＋的清除能力有顯著差異，其總抗氧化能力由高到低依次為：乙酸乙酯層＞氯仿層＞正丁醇層＞剩余水層。

圖2 龍眼核各萃取物及Trolox對ABTS·＋的清除Figure 2 The ABTS·＋radical scavenging activities ofTrolox and four fractions of Longan seeds

2.2.2 清除DPPH·的能力 由圖3可知，在一定質量濃度范圍內，各物質的抗氧化能力都隨濃度的增加而增強。乙酸乙酯層和氯仿層對DPPH·的清除能力都比抗壞血酸強，隨著濃度增加，清除率很快達到平衡，其IC50值分別為0.13，0.16mg/mL，抗壞血酸的IC50值為0.35mg/mL。而正丁醇層和剩余水層對DPPH·的清除能力相對較弱，當濃度為2mg/mL時，清除率分別為37.23%和31.77%，由于正丁醇層和剩余水層對DPPH·的清除能力太低，因此未能測出IC50值。

圖3 龍眼核各萃取物及抗壞血酸對DPPH·的清除能力Figure 3 The DPPH·radical scavenging activities of ascorbic acid and four fractions of Longan seeds

圖4 龍眼核各萃取物和抗壞血酸對·的清除能力Figure 4 The·radical scavenging activities of ascorbic acid and four fractions of Longan seeds

2.2.4 清除·OH的能力 羥基自由基是自由基中最為活躍的，其來源可由H2O2在金屬離子如Fe2＋、Cu2＋的催化下進行Fenton反應（Fe2＋＋H2O2→Fe3＋＋OH－＋·OH）所生成。·OH極易與生物體分子反應，引起DNA鏈斷裂、蛋白質變性、酶失活、生物膜結構損傷、細胞解體乃至機體病變和死亡，所以·OH是對生物體危害最大的活性氧物質。

由于龍眼核各萃取物中主要抗氧化物質多酚的含量存在顯著差異，多酚濃度過高易與鐵離子結合形成一種紫色絡合物，從而影響對反應液吸光度的觀察，為了更好地觀察它們對·OH的清除效果，故選擇了不同的濃度范圍。由圖5可知，各物質清除·OH均有明顯的量效關系。在相同濃度范圍內，抗壞血酸的·OH清除能力大于正丁醇萃取物，當濃度為1mg/mL時，其清除率基本持平，分別為56.56%和56.36%。乙酸乙酯層對·OH的清除效果最好，其次是氯仿層，當達到其最大濃度時，清除率分別為70.45%和55.19%，而水層的清除能力最弱，最高為49.92%。除水層外，抗壞血酸、正丁醇層、氯仿層和乙酸乙酯層的IC50分別為525.2，712.5，459.8，130.5μg/mL。

2.3 龍眼核粗提物不同極性部位的抑菌活性

圖5 龍眼核各萃取物及抗壞血酸對·OH的清除能力Figure 5 The·OH radical scavenging activities of ascorbic acid and Four fractions of Longan seeds

通過牛津杯法對龍眼核粗提物不同極性部位的抑菌效果進行比較，結果（表1）表明，除水層對沙門氏菌和大腸桿菌均無明顯抑制作用外，4種萃取物對沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有不同強度的抑制作用，且對革蘭氏陽性菌的抑制效果明顯強于對革蘭氏陰性菌的抑制效果。其中乙酸乙酯層對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果最強，其抑菌圈直徑分別為15.0，18.1，18.9mm。另外，試驗中阿莫西林對金黃色葡萄球菌的抑制作用很強，說明這一種金黃色葡萄球菌為不產β－內酰胺酶的葡萄球菌。不同濃度的氯仿層和乙酸乙酯層對這3種致病菌均有較好的抑制作用，并呈現出良好的劑量效應關系。

表1 龍眼核各萃取物的抑菌圈直徑Table 1 The diameter of antiblatstic circle of different extract from longan seeds（x ±sd，n＝3）

表1 龍眼核各萃取物的抑菌圈直徑Table 1 The diameter of antiblatstic circle of different extract from longan seeds（x ±sd，n＝3）

“－”表示無抑菌圈，阿莫西林為1mg/mL。

供試樣品 濃度/（mg·mL－1）沙門氏菌/mm大腸桿菌/mm金黃色葡萄球菌/mm氯仿層乙酸乙酯層正丁醇層水層 陰性對照陽性對照2.5 5.0 10.0 2.5 5.0 10.0 2.5 5.0 10.0 2.5 5.0 10.0無菌水95%乙醇阿莫西林－8.7±0.6 10.5±0.9 10.5±0.8 11.7±1.1 15.0±1.3－ －9.1±0.6 －－－－－17.2±2.1 9.3±0.7 9.9±0.9 11.0±0.7 14.3±1.1 14.7±1.4 18.1±1.7－ －9.4±0.6－－－－－14.6±1.1 9.8±0.7 11.6±0.9 15.4±1.3 13.9±1.1 15.1±1.0 18.9±1.4 12.1±0.9 16.5±1.1 18.5±1.3 11.6±0.7 13.0±0.8 14.6±1.1 － －40.7±2.3

3 討論

用不同極性的有機溶劑對龍眼核95%乙醇提取物進行萃取，發現不同萃取物的總酚含量存在顯著差異，其中乙酸乙酯層的總酚含量最高，達到69.35%。體外抗氧化試驗中，龍眼核4種萃取物在不同的抗氧化體系中對不同的自由基表現出不同的清除能力，總體上表現為對ABTS·＋、DPPH·的清除能力強于對·OH的清除能力，而對·的清除能力表現最弱，這可能與龍眼核抗氧化活性成分對不同自由基的敏感性及作用機理差異有關，這與黃曉冬［13］的研究結果基本一致。在試驗范圍內，4種萃取物對ABTS·＋、DPPH·和·OH的清除作用由強到弱依次為：乙酸乙酯萃取物＞氯仿萃取物＞正丁醇萃取物＞水層剩余物。說明龍眼核中的多酚類抗氧化物質主要為小分子化合物，極性較小，易溶于乙酸乙酯等極性較小的有機溶劑，導致乙酸乙酯部分總酚含量最高［25］。而抗氧化活性與總酚含量直接相關，總酚含量越高，則其抗氧化活性越好。因此乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性最強，氯仿萃取物的抗氧化活性次之，而剩余水層物的抗氧化活性則最弱。

體外抑菌試驗顯示，除剩余水層物對沙門氏菌和大腸桿菌均無明顯抑制作用外，4種萃取物對沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有不同強度的抑制作用，且對革蘭氏陽性菌的抑制效果明顯強于對革蘭氏陰性菌的抑制效果，其原因可能與兩種菌在細胞壁結構組成上的差異有關。一般革蘭氏陽性菌細胞壁的主要成分是肽聚糖和少量磷壁酸，它對糖類、氨基酸和大部分離子來說容易透過，溶質通透性較強，且一般對青霉素、磺胺類藥物敏感；而革蘭氏陰性菌的細胞壁結構復雜，由肽聚糖層和外膜構成，不太容易被破壞，且外膜的負電荷較強，能控制某些物質的進出［26］。龍眼核剩余水層物中的成分多為蛋白質、多糖、鞣質等大分子化合物，難以通過革蘭氏陰性菌的細胞壁并影響其生長代謝，所以它對沙門氏菌和大腸桿菌均無明顯抑制作用，而對革蘭氏陽性菌的抑制作用較為明顯。同時，龍眼核各萃取物中多酚含量的不同使其對這3種供試菌的抑菌活性產生了差異，說明龍眼核中的多酚類物質可能是主要的抑菌活性成分。龍眼核中所含有的多酚類物質種類繁多，抑菌機制也多樣化，雖然龍眼核不同極性萃取物對3種所試菌種表現出一定的抑菌作用，但還有必要進一步擴大供試菌種類，確定其抑菌譜和研究其抑菌機理，且需要進一步分離純化其多酚類物質，以篩選出更加明確有效的抑菌活性成分。

龍眼核自古以來就被用來作為止血定痛，理氣化濕，治創傷出血、疝氣等病癥的中藥材，龍眼核中含有較為豐富的黃酮類和酚酸等多酚類物質，其主要的化學成分和結構逐漸被確定，所具有的抗氧化、抑菌、降血糖和抗癌等藥理活性的研究也屢見報道［8－12，27］。因此，龍眼加工過程中廢棄的龍眼核可以作為一種藥用植物資源被加以綜合開發利用，為中國的龍眼產業創造出更多的經濟效益，并造福于人類。

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