核桃青皮中多酚的超高壓提取工藝優化

宋麗軍 侯旭杰 李雅雯 張 麗（1.塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 8400；2.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆阿拉爾 8400；.南疆食品檢驗所，新疆 阿拉爾 8400）

核桃青皮，又稱青龍衣，是核桃加工過程中的副產物，據統計［1］，截止2010年底，新疆核桃青皮產量已達到13.41萬t。核桃青皮中含有豐富的多酚類化合物，如綠原酸、香草酸、槲皮素、沒食子酸、核桃酮等［2－4］，具有較強的抗氧化活性，有抗衰老、治療心腦血管疾病、降血脂、抗癌、抗輻射等生理功能［1，5］。但長期以來，核桃青皮均作為廢渣拋棄，造成了極大的環境污染和資源浪費。

趙國建等［6］分別比較了溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、六偏磷酸鈉（SHMP）輔助提取法對核桃青皮多酚的提取效果，其中SHMP輔助提取法效果最佳，多酚得率為4.01mg/g，且需在70℃繼續提取120min；房祥軍等［7］采用50%丙酮—水溶液提取多酚得率為4.71%，但需連續提取3次，總提取時間達到4.5h。傳統的提取方法普遍存在提取時間長、溫度高、提取效率低等缺點。

超高壓處理可以破壞物料的細胞壁、細胞膜等結構，促使細胞內容物和提取溶劑充分接觸，加快提取速度，具有提取率高、提取溫度低，以及可避免熱效應引起的有效成分損失和生理活性降低等優點［8］。近年來，超高壓提取技術已廣泛應用于皂苷［8］、多糖［9］、茶多酚［10］、齊墩果酸［11］、茶樹花精油［12］等生物活性成分的提取研究中，并取得了良好的效果，但有關核桃青皮多酚的超高壓提取研究卻未見報道。本研究擬采用超高壓技術提取核桃青皮中的多酚類物質，采用響應面法優化多酚提取工藝，為核桃青皮多酚類物質提取提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

核桃青皮：新疆薄皮核桃溫185核桃青皮，樹齡21～23年，2012年10月2日購于新疆阿拉爾市。由于不同品種、生長期的核桃中多酚含量差異較大，本試驗原料一次性采集。

福林—酚試劑、沒食子酸：美國Sigma公司。

乙醇、無水碳酸鈉等均為國產分析純。

1.1.2 主要儀器設備

減壓干燥箱：DHG－9101－1S型，上海鴻都電子科技有限公司；

恒溫水浴鍋：HH－S6型，上海博訊事業有限公司醫療設備廠；

粉碎機：FZ102型，北京市永光明醫療儀器廠；

臺式高速冷凍離心機：Neofuge 15R型，北京陽光思特生物技術有限公司；

紫外可見分光光度計：UV－Mini1240型，日本島津公司；

電子天平：MA110型，上海臺衡儀器儀表有限公司；

超高壓處理裝置（圖1）：HPP.L.2－600/0.6型，工作壓力0～600MPa，工作溫度－10～60℃，傳壓介質為水，天津市華泰森淼生物工程技術有限公司。

圖1 超高壓提取多酚示意圖Figure 1 The schematic diagram of extra－high pressure extraction

1.2 方法

1.2.1 提取工藝

核桃青皮→預處理→減壓干燥→粉碎、過篩→樣品、溶劑混合→真空包裝→預熱、超高壓處理（間歇加壓提取兩次）→離心→上清液→測定總多酚

操作要點：核桃青皮切分后于50℃減壓干燥，粉碎，過80目篩，置于棕色瓶中密封，－18℃冷凍保藏備用。取5g粉末與50%乙醇—水混合，避光、真空包裝，預熱3min后采用超高壓提取2次，兩次加壓間隔時間3min（包含升降壓時間），離心后取上清液，測定總多酚含量。

1.2.2 多酚類定性試驗 參照文獻［5］。

1.2.3 總多酚測定 采用福林—酚法［6］。沒食子酸標準溶液標準曲線為：y＝0.102 8x－0.008 4（R2＝0.998 6）。樣品中的多酚以沒食子酸的含量表示，單位為mg/g。多酚得率按式（1）計算：

式中：

R——多酚得率，mg/g；

m1——核桃青皮質量，g（干基）；

m2——核桃青皮提取液中多酚含量，mg（干基）。

1.2.4 單因素試驗設計

（1）壓力對多酚提取效果的影響：以50%的乙醇—水為提取溶劑，在保壓時間5min、液料比30∶1（V∶m）、提取溫度40℃條件下，分別設置提取壓力100～600MPa，研究提取壓力對多酚提取效果的影響。

（2）溫度對多酚提取效果的影響：以50%的乙醇—水為提取溶劑，在提取壓力300MPa、保壓時間5min、液料比30∶1（V∶m）條件下，分別設置提取溫度20～60℃，研究提取溫度對多酚提取效果的影響。

（3）時間對多酚提取效果的影響：以50%的乙醇—水為提取溶劑，在提取壓力300MPa、液料比30∶1（V∶m）、提取溫度40℃條件下，分別設置提取時間2～7min，研究提取時間對多酚提取效果的影響。

（4）液料比對多酚提取效果的影響：以50%的乙醇—水為提取溶劑，在提取壓力300MPa、提取溫度40℃、提取時間5min條件下，分別設置液料比10∶1～60∶1（V∶m），研究液料比對多酚提取效果的影響。

以上試驗均做3個平行，取平均值。

1.2.5 響應面優化試驗 在單因素試驗基礎上，選取對核桃青皮多酚影響顯著的因素，運用Design Expert 8.05軟件，根據Box－Behnken試驗設計原理，以多酚得率為響應值，進行響應面試驗并對試驗數據進行回歸分析，優化核桃青皮多酚提取條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 核桃青皮多酚提取液定性試驗 由表1可知：定性試驗均顯示陽性結果，說明核桃青皮提取物中含有多酚類物質。

表1 核桃青皮提取液多酚類定性試驗Table 1 Qualitative test of polyphenols extracted from walnut green peel

2.1.2 提取溫度對多酚得率的影響 由于高溫極易造成多酚類物質的損失，故本試驗設定提取溫度低于60℃。由圖2可知，在超高壓條件下，溫度對多酚得率有顯著影響。20℃時多酚得率為6.454mg/g，40℃時多酚得率為6.875mg/g，增幅為0.420mg/g。當溫度大于40℃時，多酚得率增幅不顯著。因此，后續試驗提取溫度選擇40℃。

圖2 提取溫度對核桃青皮多酚得率的影響Figure 2 Effect of temperature on the extraction efficiency of polyphenols

2.1.3 提取壓力對核桃青皮多酚得率的影響 由圖3可知，當壓力小于300MPa時，隨著壓力的增大，多酚得率迅速增加，增幅達到1.895mg/g；當壓力大于300MPa時，隨著壓力的增加，多酚得率小幅度增加，增幅為0.210mg/g。本試驗采用二次加壓提取法，在升壓和卸壓過程中，對物料細胞造成極大的壓力差，使細胞壁和細胞膜透通性發生變化，細胞內容物紊亂、外泄，增大了提取溶劑與有效成分的接觸面積，降低了傳質阻力，從而使其傳質速率加快［8］，提高得率。考慮設備成本及效率，確定后續試驗提取壓力為300MPa。

圖3 提取壓力對核桃青皮多酚得率的影響Figure 3 Effect of pressure on the extraction efficiency of polyphenols

圖4 提取時間對核桃青皮多酚得率的影響Figure 4 Effect of time on the extraction efficiency of polyphenols

2.1.4 提取時間對多酚得率的影響 由圖4可知，提取時間對核桃青皮多酚得率有顯著影響。當保壓時間小于5min時，隨著時間的延長，多酚得率顯著增加，增幅達到1.883mg/g；當時間為5～8min時，多酚得率緩慢增加，增幅只有0.286mg/g。可能是在高壓條件下，物料細胞內產生劇烈的渦流擴散，有效成分傳質速率快，因此在較短時間內（5min）便可使細胞內部和外部的多酚濃度達到平衡；之后再延長保壓時間，多酚也無法由細胞內部向提取溶液中擴散［8］。因此，后續試驗選擇保壓時間為5min。

2.1.5 液料比對多酚得率的影響 多酚類化合物的提取過程由滲透、溶解、擴散幾個步驟組成，其中擴散為最主要的作用。提取過程中，溶劑與原料的比值越大，則濃度梯度越大，多酚的擴散速率越大［13］。由圖5可知：在液料比10∶1～30∶1（V∶m）范圍內，隨著溶劑量的增加，多酚得率由3.942mg/g增加到6.873mg/g，增幅達到2.991mg/g；當液料比大于30∶1（V∶m）時，增幅變緩，尤其是液料比大于40∶1（V∶m）時，多酚得率基本趨于穩定?？紤]到液料比過大，不僅會消耗大量的溶劑，而且會降低提取液中有效成分的濃度，給后續分離純化過程帶來困難［10］。因此，后續試驗選擇液料比1∶30（m∶V）。

圖5 液料比對核桃青皮多酚提取率的影響Figure 5 Effect of liquid ratio on the extraction efficiency of polyphenols

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗設計與結果 在單因素試驗基礎上，選取溫度、壓力、時間、液料比4個因素，運用 Design Expert 8.05軟件的Box－Behnken原理進行試驗設計。各因素及水平見表2，試驗設計及結果見表3。

表2 響應面設計因素水平表Table 2 Levels and codes of variables chosen for design

表3 響應面設計與試驗結果Table 3 The experimental and predicted values of polyphenols extraction

以多酚得率為響應值（Y），利用Design Expert 8.05軟件對表3數據進行二次多元回歸擬合，得到響應值對自變量的多元回歸方程（2）：

由表4可知：Fmodel＝49.61，P＜0.000 1，表明模型（2）極顯著，R2＝0.980 2，AdjR2＝0.960 5，Adeq Precision＝27.068，說明該模型擬合程度良好，試驗誤差小，該模型可以用來分析和預測超高壓提取核桃青皮多酚的效果。

表4 試驗結果方差分析表Table 4 Analysis of variance for quadratic regression equation

表4 試驗結果方差分析表Table 4 Analysis of variance for quadratic regression equation

＊表示0.05水平顯著；＊＊ 表示0.01水平顯著。

變異來源 平方和 自由度 均方 F值 Pr＞F 顯著性模型 5.992 6 14 0.428 49.61 ＜0.000 1＊＊X10.029 2 1 0.029 2 3.385 0.087 1 X21.060 9 1 1.060 9 123.0 ＜0.000 1 ＊＊X30.933 5 1 0.933 5 108.2 ＜0.000 1 ＊＊X43.194 0 1 3.194 370.2 ＜0.000 1 ＊＊X1X20.000 3 1 0.000 3 0.033 0.857 4 X1X30.008 6 1 0.008 6 1.002 0.333 7 X1X40.018 0 1 0.018 2.081 0.171 1 X2X30.043 7 1 0.043 7 5.063 0.041 0 ＊X2X40.121 1 1 0.121 1 14.04 0.002 2 ＊X3X46E－05 1 6E－05 0.007 0.936 8 X21 0.159 3 1 0.159 3 18.46 0.000 7 ＊X22 0.138 2 1 0.138 2 16.02 0.001 3 ＊X23 0.087 4 1 0.087 4 10.13 0.006 6 ＊X24 0.453 2 1 0.453 2 52.53 ＜0.000 1 ＊＊殘差 0.120 8 14 0.008 6失擬 0.111 6 10 0.011 2 4.855 0.070 7誤差 0.009 2 4 0.002 3總和6.113 3 28

模型（2）中一次項 X2、X3和X4極顯著，交互項 X2X3和X2X4顯著，、和顯著，極顯著，其它不顯著。對表2的數據進行回歸分析，剔除不顯著交互項，得到核桃青皮多酚得率（mg/g）對各自變量的標準回歸方程（3）：

根據一次項自變量系數可知，各自變量對響應值的影響大小順序為：X4（液料比）＞X2（壓力）＞X3（時間）＞X1（溫度）。

圖6、7為壓力和時間、壓力和液料比對核桃青皮多酚提取效果的影響，通過等高線及響應面圖可直觀地反映出不同變量間交互作用的顯著程度，等高線越扁平說明因素之間交互作用越顯著，對多酚得率的影響越大。由圖6、7可知：壓力和時間交互作用、壓力和液料比交互作用的等高線均呈現橢圓、扁平狀，表示上述因素之間的相互作用顯著。

圖6 Y＝f（X2，X3）的響應面和等高線圖Figure 6 Response surface and contours of Y＝f（X2，X3）

圖7 Y＝f（X2，X4）的響應面和等高線圖Figure 7 Response surface and contours of Y＝f（X2，X4）

2.2.2 驗證實驗結果 根據軟件和模型進行參數優化分析，得到核桃青皮多酚超高壓提取的最佳工藝條件為：溫度42.19℃，壓力309.09MPa，時間6.00min，液料比39.69∶1（V∶m），在此條件下預測得率為7.35mg/g。結合實際操作情況，將上述最優工藝調整為：溫度42℃，壓力310MPa，時間6min，液料比40∶1（V∶m）。在此優化工藝條件下，3次驗證實驗的多酚得率分別為7.31，7.45，7.49mg/g，平均值為7.417mg/g，驗證值與預測值相對誤差相差較小，說明了模型的有效性。

3 結論

本試驗在單因素基礎上，通過響應面法優化了超高壓提取核桃青皮多酚的最佳工藝為：采用超高壓二次提取法，以50%乙醇—水為提取液，粉碎粒度80目，溫度42℃，壓力310MPa，時間6min，液料比40∶1（V∶m），此條件下多酚得率為7.417mg/g。本研究的不足之處在于未對超高壓條件下多酚類物質的傳質機理及其動力學進行深入研究，下一步需針對上述問題進行深入探討。

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