純種米曲霉AS3.042制曲黃豆醬的后發酵條件優化

康 蕾 劉素純 胡茂豐（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

自然發酵是自制黃豆醬最常見的發酵方式，在工廠與實驗室中多采用人工接種不同菌種的方式來獲得不同口感的產品［1，2］。最常見的制曲菌種為純種米曲霉，其優勢在于蛋白酶活力強［3］。經過制曲階段菌種分解大豆產生蛋白質、糖類等有機物，在加入鹽水的制醬過程中，這些有機物會在酵母菌及乳酸菌等的作用下進行分解產生醇、醛、酸、酚、酯類物質。其中氨基酸態氮含量［4］常作為評判醬品質的指標。筆者［5］前期曾分別用米曲霉、高大毛霉、根霉、黑曲霉等菌種制曲制醬，發現米曲霉制曲醬的效果最好，其游離氨基酸含量為174.17mg/g（干基），揮發性物質種類多于其他3種醬，對香味有貢獻的物質含量也最多，在香味和營養價值方面最理想。吳蘭芳等［6］曾對曲霉型豆豉制取工藝進行優化，但目前尚未有關于用響應面法優化純種米曲霉AS3.042制曲黃豆醬后發酵條件的研究。

本研究選取純種米曲霉AS3.042制曲發酵黃豆醬，在單因素試驗的基礎上以氨基酸態氮含量為考察指標，采用響應面分析法優化后發酵溫度、鹽水添加量、鹽水濃度，旨在提高原料轉化率，降低生產成本，為黃豆的綜合利用和開發提供依據。研究［5］表明，黃豆醬在后發酵進行40d左右時氨基酸態氮含量開始趨于穩定，因此本研究選取后發酵40d的醬測定其氨基酸態氮含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃豆：市售；

米曲霉（Aspergillus oryzae）3.042：湖南農業大學食品科技學院教研室提供。

1.1.2 主要儀器設備

電子分析天平：BT125D型，廣州深華生物技術有限公司；

pH計：PHS－3E型，上海雷磁儀器廠；

電熱恒溫培養箱：DNP－9052E型，廣州滬瑞明儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃豆醬制作工藝流程

大豆除雜→清洗3遍→浸泡（10h）→瀝干蒸煮→接種制曲→成曲→加鹽水拌勻→入壇發酵→后期成熟→成品［5］

1.2.2 氨基酸態氮含量測定 稱取后發酵期為40d的黃豆醬5g研磨均勻后，采用甲醛法［7］測定其氨基酸態氮含量，每個樣品做3次平行。

1.2.3 單因素試驗設計 本試驗選取氨基酸態氮作為評價指標，分別考察后發酵溫度、添加鹽水濃度、鹽水添加量。121℃蒸煮25min，待大豆冷卻到40℃時加入純種米曲霉AS3.042，接種量為1%，于一定溫度下培養48h，即得曲坯。

（1）后發酵溫度對黃豆醬氨基酸態氮含量的影響：向曲坯中加入濃度為10%體積為曲坯70%的鹽水，拌勻，放入陶瓷壇子中于30，35，40，45，50℃保溫后發酵。

（2）鹽水濃度對黃豆醬氨基酸態氮含量的影響：向曲坯中加入濃度為6%，8%，10%，12%，14%（質量百分數）體積為曲坯70%的鹽水，拌勻，放入陶瓷壇子中于40℃保溫后發酵。

（3）鹽水添加量對黃豆醬氨基酸態氮含量的影響：向曲坯中加入濃度為10%體積為曲坯40%，60%，80%，100%，120%（體積百分數）的鹽水，拌勻，放入陶瓷壇子中于40℃保溫后發酵。

1.2.4 響應面優化試驗方案 取后發酵期為40d的黃豆醬采用響應面法進行試驗數據處理，選用Box－Behnken模型對影響黃豆醬氨基酸態氮含量的因素進行響應面設計［8］，以氨基酸態氮含量為響應值進行黃豆醬后發酵條件（溫度、鹽水濃度、鹽水添加量）的優化，以得到氨基酸態氮含量更高的黃豆醬。

2 結果與分析

2.1 后發酵溫度對氨基酸態氮含量的影響

圖1 后發酵溫度對氨基酸態氮含量的影響Figure 1 Effect of ferment temperature on the figure of nitrogen amino acid

由圖1可知，后發酵溫度很大程度上影響了醬品氨基酸態氮含量，氨基酸態氮含量隨著溫度的增加先增加后降低，當溫度超過40℃時，氨基酸態氮含量逐漸下降，所以選擇40℃為最適宜后發酵溫度。高溫可以促進蛋白酶作用，縮短蛋白酶水解的時間，但所得產品的風味不濃厚，且色澤偏深；低溫有利于產品風味濃厚，但所需時間較長［9］。根據SAS 8.2數據分析軟件處理可知，溫度對氨基酸態氮含量影響顯著（P＜0.05）。

2.2 鹽水濃度對氨基酸態氮含量的影響

由圖2可知，鹽水濃度對黃豆醬氨基酸態氮含量的影響較大，氨基酸態氮含量隨著鹽水濃度增加先增加后降低，當濃度超過10%（質量百分數）后，氨基酸態氮含量逐漸下降，所以選擇10%（質量百分數）為最適宜添加鹽水濃度。不僅可以抑制酸敗細菌的生長還可以保持蛋白酶有較高的活性［10］。根據SAS 8.2數據分析軟件處理可知，添加鹽水濃度為10%（質量百分數）時對氨基酸態氮含量影響顯著（P＜0.05）。

圖2 鹽水濃度對氨基酸態氮含量的影響Figure 2 Effect of density of added salty water on the figure of nitrogen amino acid

2.3 鹽水添加量對氨基酸態氮含量的影響

圖3 鹽水添加量對氨基酸態氮含量的影響Figure 3 Effect of adition of salty water on the figure of nitrogen amino acid

由圖3可知，鹽水添加量對氨基酸態氮含量的影響較大。黃豆醬中氨基酸態氮含量隨著鹽水添加量增加先增加后降低，但是當添加量超過80%（體積百分數）后，氨基酸態氮含量逐漸下降，所以選擇80%（體積百分數）為最適宜鹽水添加量。水分太少會抑制酶活性，影響蛋白質和淀粉等成分的水解，反之水分太多又會降低蛋白酶反應速率，使得產品氨基酸態氮含量不高，導致風味不足［11］。根據SAS 8.2數據分析軟件處理可知，鹽水添加量為80%（體積百分數）時對氨基酸態氮含量影響顯著（P＜0.05）。

2.4 響應面試驗結果與分析

2.4.1 Box－Behnken響應面設計及結果 綜合單因數試驗結果，選后發酵溫度、鹽水濃度、鹽水添加量3個因素，用Design－Expert 8.0.6軟件按照Box－Behnken原理進行3因素3水平響應面設計。試驗設計見表1，試驗方案及結果見表2。

2.4.2 回歸方程的建立與檢驗 通過對試驗數據分析，建立氨基酸態氮含量對后發酵溫度、鹽水濃度、鹽水添加量的二次多項回歸方程見式（1）：

由表3可知，該模型P＜0.000 1，表明二次回歸方程模型極顯著，模型的相關系數R2＝0.997 3，校正決定系數＝0.993 8，失擬項P＝0.245 1＞0.05，失擬向不顯著，故對后發酵條件的研究可以采用該模型。

表1 BBD試驗設計因素水平表Table 1 Independent variables their levels used for BBD

各因素對氨基酸態氮含量的影響均顯著（表3），其中鹽水濃度與鹽水添加量對氨基酸態氮含量的影響極顯著，表明鹽水濃度與鹽水添加量對氨基酸態氮含量的影響都很大，交互項AB顯著，即后發酵溫度與鹽水濃度存在交互作用，表明后發酵溫度與鹽水濃度對氨基酸態氮含量的影響不是簡單的線性關系。＊＊＊表示差異極顯著（P＜0.001）；＊＊表示差異高度顯著（P＜0.01）；＊表示差異顯著（P＜0.05）；R2＝0.997 3；＝0.993 8。

表2 Box－Behnken試驗設計及結果Table 2 Box－Behnken experimental design and results

表3 回歸模型分析Table 3 Analysis of regression model

表3 回歸模型分析Table 3 Analysis of regression model

方差來源 平方和 自由度 均方 F值 P 值 顯著性模型 0.075 9 8.322×10－3 284.18 ＜0.000 1＊＊＊A 3.125×10－4 1 3.125×10－4 10.67 0.013 7 ＊B 6.050×10－3 1 6.050×10－3 206.59 ＜0.000 1 ＊＊＊C 3.612×10－3 1 3.612×10－3 123.35 ＜0.000 1 ＊＊＊AB 2.250×10－4 1 2.250×10－4 7.68 0.027 6 ＊AC 1.000×10－4 1 1.000×10－4 3.41 0.107 1 BC 2.500×10－5 1 2.500×10－5 0.85 0.386 3 A2 0.028 1 0.028 943.30 ＜0.000 1 ＊＊B2 0.012 1 0.012 411.52 ＜0.000 1 ＊＊C2 0.018 1 0.018 626.28 ＜0.000 1 ＊＊殘差 2.050×10－3 7 2.929×10 －5失擬向 1.250×10－4 3 4.167×10－5 2.08 0.245 1 不顯著純誤差 8.000×10－3 4 2.000×10－5總和0.075 16

2.4.3 因素間交互作用分析 由圖4可知，當鹽水添加量固定在80%（體積百分數）時，研究后發酵溫度與鹽水濃度對氨基酸態氮含量的交互影響，氨基酸態氮含量隨著后發酵溫度與鹽水濃度的增加而提高，在40℃左右，8%（質量百分數）時含量最高，后發酵溫度與鹽水濃度對氨基酸態氮含量影響顯著，兩者對氨基酸態氮含量的提高起到了一定的作用。由圖5可知，當鹽水添加量為80%（體積百分數），后發酵溫度與鹽水濃度的交互作用不顯著，在所選范圍內無極值；由圖6可知，當溫度固定在40℃時，鹽水濃度與添加量的交互作用不顯著，在所選范圍內無極值。

圖4 后發酵溫度與鹽水添加量對氨基酸態氮含量的響應面分析Figure 4 The Response surface of effects of temperature and adition of salty water on the figure of nitrogen amino acid

圖5 后發酵溫度與鹽水濃度對氨基酸態氮含量的響應面分析Figure 5 Response surface plots of effects of temperature and density of added salty water on the figure of nitrogen amino acid

圖6 鹽水濃度與鹽水添加量對氨基酸態氮含量的響應面分析Figure 6 The Response surface of effects of density of added salty water and adition of salty water on the figure of nitrogen amino acid

2.4.4 響應面優化模型診斷 實際值與回歸估計值的差稱為殘差，通過殘差信息，可分析數據的可靠性、周期性或其它干擾。殘差分析原理是在模型無法完全解釋變異的基礎上借助圖形分析工具進行分析的，通常用于診斷響應面優化模型的好壞［12］。檢驗誤差方差齊性在模型診斷中具有重要意義。如果預測值內部t化殘差呈隨機散點分布，則殘差方差齊性是合符要求的［13］。此外，殘差正態分布也是檢驗模型準確性的重要工具，如殘差呈正態概率分布，則殘差擬合曲線呈線性態勢（圖7）［14］。由圖8可知，模型預測值與實測值擬合度較高，試驗誤差較小。模型預測值與實測值若擬合良好，則數據散點分布且沿模型診斷線呈近似直線分布。微擾曲線（perturbation plot）可在響應優化曲面特定區域比較各自變量對響應值的影響，如曲線陡直，表明響應值對因素敏感，如曲線平緩，則表明響應值對因素變化不敏感。由圖9可知，因素B（鹽水添加量）對響應值最敏感，因素C（鹽水濃度）對響應值較為敏感，而A（后發酵溫度）對響應值變化不敏感。因此，因素B為最重要因素，其影響為正影響［15］。

圖8 模型預測值VS實測值Figure 8 Predicted vs.Actual

圖9微擾曲線Figure 9 Perturbation plot

2.4.5 優化后發酵工藝參數的驗證 采用Design Expert軟件，分析得到的最佳工藝條件為：后發酵溫度40.28℃、鹽水添加量74.7%（體積百分數）、鹽水濃度9.66%（質量百分數），產品氨基酸態氮含量為0.841g/kg。采用黃豆醬后發酵條件為溫度40.3℃、鹽水添加量74.7%（體積百分數）、鹽水濃度為9.7%（質量百分數），進行3次平行驗證實驗，黃豆醬的氨基酸態氮含量平均值為0.837 6g/kg，與理論值很接近。說明該工藝參數是可行的。

3 結論

本研究運用響應面法優化黃豆醬后發酵條件，通過Box－Behnken試驗設計建立數學模型并進行分析，確定黃豆醬后發酵條件為溫度40.3℃、鹽水添加量74.7%（體積百分數）、鹽水濃度為9.7%（質量百分數），該條件下氨基酸態氮含量為0.837 6g/kg。本研究采用響應面分析法優化后發酵條件，提高了原料轉化率，降低了生產成本，對發酵豆類調味品的綜合利用和開發具有較大參考價值。

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