DNA條形碼技術在深圳魚肉制品鑒定中的應用

王 敏，劉 葒，黃 海，趙曉萌，石 瓊，何舜平,4，孫 穎,*

（1.深圳華大基因研究院，廣東 深圳 518083；2.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518045；3.三亞市南繁科學技術研究院，海南 三亞 572000；4.中國科學 院水生生物研究所，湖北 武漢 430072）

DNA條形碼技術在深圳魚肉制品鑒定中的應用

王 敏1，劉 葒2，黃 海3，趙曉萌1，石 瓊1，何舜平1,4，孫 穎1,*

（1.深圳華大基因研究院，廣東 深圳 518083；2.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518045；3.三亞市南繁科學技術研究院，海南 三亞 572000；4.中國科學 院水生生物研究所，湖北 武漢 430072）

以線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）基因為目標基因，應用DNA條形碼技術鑒別深圳批發市場和超市零 售魚肉制品的種類來源，判別其產品標簽是否正確。本研究調查的77 份魚肉制品均能擴增出特異性條帶，28 份樣品與產品標簽標示不符，“錯貼”率高達36.36%，其中所有標示“龍俐魚”的商品都是低價的“巴丁魚”（Pangasianodon hypophthalmus）。DNA條形碼技術可用于魚肉制品的來源物種鑒定。

DNA條形碼；COⅠ基因；物種鑒定；魚肉制品

我國是魚肉消費大國，魚肉制品繁多，包括生魚片、冷凍加工品（魚片或魚段）、烤魚片和魚糜制品等。近年來，魚肉制品的摻假行為頻頻曝光，給人們的健康造成嚴重威脅[1-3]。魚肉制品錯貼標簽的現象并非中國獨有，一些歐洲國家的商販也以次充好，賺取更高利潤。如，在抽檢的德國產鰈類魚中，1/4與標注名稱不符；24%的西班牙產蝦肉樣品中存在欺詐行為；在奧地利，一些價格昂貴的比目魚、挪威三文魚也通常成為假冒的對 象[4]。

DNA條形碼的概念由加拿大生物學家Paul Hebert在2003年首次 提出[5-6]，是一種利用 線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（mitochondri al cytochrome C oxidase subunitⅠ，COⅠ）基因，一段長度為648 bp的片段，對物種進行準確、快速鑒定的方法。在國外，DNA條形碼技術已用于魚肉制品的真假鑒別。Cawthom等[7]利用DNA條形碼技術研究南非市場的魚類，發現在批發商和零售商中貼錯標簽的比例差別巨大；Laura等[8]利用DNA條形碼技術對意大利市場上的69 份魚類樣品進行分析，發現有22 個樣本（32%）存在錯貼標簽現象；Wong等[9]利用DNA條形碼技術對市場上的91 個樣品進行分析，發現有25%的海產品的標簽與實物不符；Holems等[10]研究了澳大利亞附近海域的221 份魚翅樣品，結果發現有許多鯊魚被列入世界自然保護聯盟紅色名錄，一種鯊魚為極度瀕危物種；美國海洋環境保護組織在2010—2012年期間通過DNA條形碼技術研究全美境內1 247 份魚類制品，發現有1/3的商品存在錯貼標簽現象[11]。但在我國DNA條形碼技術主要集中在分類學和物種鑒定研究中[12-15]，而用于食品鑒定的文獻報道較少，在魚肉鑒定方面也是最近兩年才有少量報道[16-18]。

本研究參照Ward等[19]的方法，選用COⅠ基因的通用引物，對深圳市場冷凍魚、凍魚片進行DNA提取、擴增和測序，并對線粒體COⅠ基因序列進行分析比對，旨在建立準確、高效的魚肉制品的鑒定方法，為魚肉制品進出口檢驗監管和市場安全監管等方面的應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2013年3月從市場上隨機購買77 份魚肉樣品。其中59 份整魚和凍魚塊在深圳梅林批發市場購得，其余18份魚片和魚柳等在深圳各超市購得。

無水乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇（ 均為分析純）、EB核酸染料 生工生物工程（上海）股份有限公司；Tris-飽和酚（pH 8.0） 北京索萊寶科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs（2.5 mmol/L）、DNA Marker（DL100 bp） 廣州瑞真生物科技有限公司；蛋白酶K 德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

高速離心機 德國Eppendorf公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Life Technologies公司；水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；超凈工作臺 深圳市優之凈環境科技有限公司；電泳儀 北京六一儀器廠；凝膠成像系統 上海天能科技有限公司；微量核酸蛋白測定儀 德國Implen公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本DNA提取

采用傳統的酚-氯仿法。取10 mg左右的組織于1.5 mL的離心管中，加入494 μL DNA裂解液和6 μL蛋白酶K（20 mg/mL）；將離心管于56 ℃恒溫水浴鍋中裂解3 h，水浴完后，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）溶液，搖勻至乳濁液，離心10 min，12 000 r/min；吸取上清液，轉入新的1.5 mL離心管中，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）溶液，搖勻至乳濁液，離心10 min，12 000 r/min。吸取上清液，轉入新的1.5 mL離心管中，加入2 倍體積無水乙醇溶液（提前預冷），顛倒混勻，－20 ℃靜置30 min，離心10 min，12 000 r/min；棄去上清液，體積分數75%乙醇溶液洗滌2 次；烘干后加入50 μL dH2O，溶解DNA；取2 μL制備1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，同時吸取1 μL稀釋后使用紫外分光光度計進行檢測；將原液存放于－20 ℃冰箱保存。

1.3.2 COⅠ基因的PCR擴增和測序魚類通用引物[19]：

FishF2_t1（5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACT AATCATAAAGATATCGGCAC-3’），VF2_t1（5’-TGTA AAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCG GCAC-3’）；FishR2_t1（5’-TGTAAAACGACGGCCAG TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’），FR1d_t1（5’-CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGA ARAAYCARAA-3’）。

PCR反應體系為25 μL：10×PCR Buffer為2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.0 μL，TaKaRa Taq（5 U/μL）0.5 μL，引物各0.25 μL，DNA模版1.0 μL，去離子水19.0 μL。PCR反應程序：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，52 ℃、40 s，72 ℃、1 min，35個循環；72 ℃、10 min。PCR擴增完成后，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，挑選擴增成功且條帶單一的產物送測。

1.3.3 序列比對及分析

將測序成功的序列人工比對拼接，將處理過的序列放到BOLD（http://www.boldsystems.org）以及NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）網站的數據庫對樣品的COⅠ序列進行鑒定以及相似度分析，再將整理后的序列和GenBank下載的相關序列應用DNAMAN 7.0軟件進行多序列比對，分析相關序列的同源性。

2 結果與分析

2.1 樣品DNA濃度及純度

電泳檢測顯示，DNA質量正常；紫外分光光度計檢測波長260 nm和波長280 nm處吸光度比值，即A260nm/ A280nm在1.8～2.0之間，滿足常規PCR反應的要求。

2.2 COⅠ基因的擴增和克隆

圖1 不同魚類樣品COI 基因的擴增條帶Fig.1 Amplifi cation of COⅠ gene sequences from different commercial fi sh products

本研究設計的引物擴增目標片段約為750 bp，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測的PCR擴增產物分子質量與設計相符（圖1）。將DNA片段純化后送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，所有77 份獲得測序序列，且經過序列比對后相似度均在98%以上，說明DNA條形碼技術可以精準地對各種凍魚、魚片以及魚柳樣品進行鑒定。

2.3 標簽符合性分析

表1 批發市場樣品鑒定結果Table1 Identifi cation results of fi sh products obtained from wholesalers

批發市場購買的59 份樣品，經基因測序后其序列與NCBI數據庫比對分析后的相似度匯總于表1。結果表明，有20 份存在標簽貼錯的混亂現象，誤貼率為33.9%，其中大多數是由于賣家沒有專業的分類知識所致。除了金線魚（Nemipterus virgatus）標為“黃花魚”（序號31）、蛇鯔（Saurida elongata）標為“九江魚”（序號41）這2 份樣品存在嚴重的錯標外，其他錯標可能是由于魚的外形不易辨別而導致的商品錯標。如眾多標有“池魚”的商品是花腹鯖（Scomber australasicus）和日本鯖（Scomber japonicus）2 種不同的魚；標有金線魚、“紅衫魚”和“紅三魚”的多屬于同一種魚；史氏低鰭鯧（Peprilus snyderi）在形態學上和南鯧（Psenopsis anomala）比較相似；長尾大眼鯛（Priacanthus tayenus）也經常被漁民當作“紅衫魚”。紅尾圓鲹（Decapterus akaadsi）與花腹鯖和日本鯖雖然在種屬差別很大，但是形態上都是長梭形，比較容易被商販誤以為是“池魚”。

表2 超市樣品鑒定結果Table2 Identifi cation results of fi sh samples obtained from supermarket

超市購買的18 份魚片和魚柳樣品經基因測序，其序列與NCBI數據庫比對分析后的相似度匯總于表2。其中，超過1/3的樣品存在以價格較低的魚標成價格較高的魚的現象。“龍俐魚”一般指舌鰨科舌鰨屬的幾種魚類，如半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）；然而此次調查所有標有“龍俐魚”的商品竟然都是低價的“巴丁魚”（Pangasianodon hypophthalmus）；而羅非魚（Oreochromis niloticus）也被標為價格較高的“鯛魚”；純正鱈魚一般為大西洋鱈魚（Gadus morhua）、格陵蘭鱈魚（Gadus ogac）和太平洋鱈魚（Gadus macrocephalus）3 種，雖然細鱗壯鱈（Albatrossiapectoralis）不能被當作傳統意義上的鱈魚，也勉強可以叫鱈魚，然而一些商家竟然將馬舌鰈魚（Reinhardtius hippoglossoides）標為“鱈魚片”；“白鯧”在一些地方也被標為金鯧即卵形鯧鲹（Trachinotus ovatu）。

33 討 論

3.1 市場錯貼標簽的種類

各種因素都可能造成商品錯標現象。1）漁民由于缺乏專業的分類學知識導致魚從剛捕撈上來就被貼錯標簽[7]，這種情況主要由于魚的形態比較相似導致，在此次調查中這類現象普遍存在，如花腹鯖、日本鯖以及紅尾圓鲹被標為“池魚”，而金線魚則被標上“金線魚”、“紅衫魚”和“紅三魚”等多種商標。2）有些魚的形態相差甚遠，但魚肉無法區分，使得一些價格較低的魚可能被標成價格較高的魚。這種行為不僅在國內時常發生，在歐美等眾多發達國家也存在，一些漁業廠商甚至有意將低價魚貼上名貴魚肉的標簽，以賺取更高利潤[4,20-22]。本實驗對收集的樣品進行檢測后發現，被誤標魚類多集中在高價值經濟魚類，如羅非魚片代替“鯛魚”，“巴丁魚”代替“龍俐魚”、“鮰魚”，“鰈魚”代替鱈魚等。

此外，一些禁止銷售的魚類，也會發生貼錯標簽現象[23]。Birstein等[24]利用DNA條形碼分析發現23%的魚子醬標注的魚類名稱錯誤，部分商品涉及瀕危魚類成分；商販也會把瀕危和受保護的物種貼成市場可以銷售的商品標簽，例如Liu等[25]研究了臺灣境內548 份魚翅樣品，結果顯示有2.5%的鯊魚物種是瀕危，50%易危，24.5%近危，僅有23%的物種是非瀕危物種的。錯貼標簽還可能導致一些魚類引發的食物中毒[26]，我國沿海地區的一些餐館會把許多有毒的河豚當作無毒的河豚販賣，最后導致悲劇的發生[1]；此次尚未檢測到瀕危物種和禁止銷售的魚類。

3.2 魚肉真偽鑒別方法

通常人們在買魚時對魚肉好壞的鑒別方法主要是憑借感覺、經驗以及喜好程度進行評判，但是這樣不能有效地分辨魚的種類。研究[27-28]表明，通過近紅外光譜法可對魚糜中水分和蛋白質含量進行快速、無損檢測。Mounier等[29]研究發現，變性高效液相色譜是一種快速、有效的肉類成分鑒定技術，可判斷魚糜及蟹棒中成分組成。酶聯免疫吸附測定法也被廣泛應用到果汁飲料、奶類產品和動物源性成分的檢測和鑒別，并且具有高靈敏度和特異性[30]。等電聚焦法和雙向電泳法可以對不同種類冷凍蝦、鱸魚進行鑒定[31-32]。

隨著分子生物技術的快速發展，近年來DNA鑒別法越來越常見，限制性片段長度多態性PCR（PCR-restrictionfragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術可以對肉類制品進行正確鑒別[33-35]，如Hsieh等[34]利用PCR-RFLP技術可以對熱處理（121 ℃，10～90 min）的河豚魚制品進行正確鑒別。擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）分子標記技術鑒別魚肉品種早有報道，如Zhang Junbin等[36]采用AFLP和變性梯度電泳鑒別虹鱒魚和大西洋鮭魚，結果表明AFLP具有更高的靈敏度，可以對鮭魚進行準確鑒定。Maldini等[37]研究表明，AFLP分子標記技術可以用于32 種冷凍魚類和家畜品種的準確鑒別，也可以用于熱處理海產品的鑒別。最近幾年來，DNA條形碼技術也已被越來越多應用到食品鑒定中[7-11,16-18,23-25,38]。

3.3 DNA條形碼技術的優勢

與傳統形態鑒定相比較，DNA條形碼技術具有諸多優勢：鑒定不依賴形態特征，不受個體差異的影響，能夠鑒定到種的水平[39-40]，對實驗人員的操作技能要求低等特點。使得物種鑒定過程變得簡單、有效和統一。與一般的蛋白質鑒定方法相比，由于DNA比蛋白質的耐熱性強，但是通過優化手段仍然可以從加工產品中提取小片段的DNA[41]；DNA本身的復雜性也可以能提供更多信息；而且DNA條形碼技術不受組織類型、年齡及狀態等因素的影響。因此，該技術具有更高的特異性、靈敏度和可靠性。

與其他DNA鑒別方法比較，DNA條形碼技術具有操作簡單、可靠快捷以及應用廣泛等優勢。PCR-RFLP在物種鑒定中已成為一個重要的方法，但由于物種的種內變異可能導致在鑒定過程中出現誤判；AFLP雖然相對可靠、操作簡便，但AFLP也會發生譜帶錯配或缺失，而且其成本也比DNA條形碼技術高[42]；微衛星標記的等位基因數目多、帶型復雜，從而導致難以判型，給DNA指紋識別自動化和規模化帶來困難[43]。

3.4 展望

盡管DNA條形碼技術具有許多優勢，然而，在食物鑒定方面還存在一些挑戰。在食物加工過程中往往會因為高溫等導致DNA降解，以及植物油、添加劑和調味料的加入對DNA提取和擴增有很大影響，這就需要對一些步驟進行各種優化；另外，一些魚丸或肉丸可能不是來自單個物種，這就無法對食物種源進行準確鑒定。此外，由于食物的種類繁多，目前的DNA條形碼數據庫雖然物種量比較豐富但還遠不夠完善，因此，在用公共數據庫進行比對分析時可能存在一些困難。

目前，我國對DNA條形碼技術的應用主要集中在分類學和物種鑒定研究中[12-15]，在應用領域處于剛剛起步的階段。今后，DNA條形碼技術在進出口物種鑒定、外來入侵物種監管和食品鑒定等方面將會發揮越來越重要的作用。

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Identifying Fish Products in Shenzhen through DNA Barcoding

WANG Min1, LIU Hong2, HUANG Hai3, ZHAO Xiaomeng1, SHI Qiong1, HE Shunping1,4, SUN Ying1,*
(1. BGI-Shenzhen, Shenzhen 518083, China; 2. Animal & Plant Inspection and Quarantine Technology Center, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, S henzhen 518045, China; 3. Sanya Science and Technology Academy for Crop Winter Multiplication, Sanya 572000, China; 4. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

In this study, DNA barcoding was applied to identify the exact species of fi sh products from Shenzhen wholesale and retail markets and to check if these products are correctly labeled. Using mitochondrial cytochrome C oxidase subunitⅠ (COⅠ) gene as the target, the sequences of COⅠ from different samples were analyzed. Our results showed that the COⅠgene sequences of all 77 samples examined were successfully amplifi ed by PCR. Howe ver, up to 36.36%（28/77）of them were inconsistent with their label descriptions, in which all the products labeled with “tongue fi sh” were actually the low-cost Pangasian odon hypophthalmus. As a simple, rapid and effi cient technology, DNA barcoding can be widely used for species identifi cation of fi sh products.

DNA barcoding; mitochondrial cytochrome C oxidase subunit Ⅰ (COⅠ) gene; species identifi cation; fi sh products

Q95

B

1002-6630（2015）20-0247-05

10.7506/spkx1002-6630-201520048

2015-01-29

深圳市科技計劃深港創新圈項目（SGLH20131010105856414）；廣東省省部產學研專項（2013B090800017）

王敏（1988—），男，碩士，研究方向為水生生物學。E-mail：wangmin2@genomics.cn

*通信作者：孫穎（1972—），女，副研究員，博士，研究方向為魚類生物學。E-mail：yingsun09@163.com