亳芍組織培養研究

李文峰，馬宗新，馬同富(.阜陽市農業科學院，安徽阜陽236065;2.阜陽師范學院，安徽阜陽23604)

亳芍即白芍，是《中國藥典》中以“亳”字命名的中藥材之一，亳州地產藥材，指芍藥科植物芍藥或其變種毛果芍藥栽培品的根。該植物為毛茛科多年生草本植物，花大而美麗，一般種植3～5年，9～10月采挖，去泥后放入開水中煮5～15 min，撈出后去皮曬干即可。加工后的芍藥呈粉白色或白色，故又稱“白芍”［1］。《藥典》稱亳芍。其性微寒，味微苦而酸。其根入藥有平抑肝陽、斂陰養血、收汗緩中之功效，具有鎮痛、鎮靜、解痙的作用，主治月經不調、經前腹痛、盜汗、頭痛等。亳芍的產量約占全國的70%以上［2］。近年來由于反復種植該物種，產生眾多的土壤病害，其產量受到了極大的威脅，因此亟待對其擴繁育苗進行研究［3－4］。筆者以種質快繁為目的，對亳州芍藥組培、脫毒快繁關鍵技術進行研究，以期為其幼苗提供質量保障，并為農民獲得安全放心苗提供技術依托。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試品種來自于安徽省亳州市中藥材研究基地，以嫩芽為供試材料。

1.2 試驗時間和地點 于2013年10月至2015年5月，在阜陽市農業科學院生物工程研發中心進行。

1.3 試驗設計 誘導培養基為MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA30.025 mg/L，擴大培養基為 MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.025 mg/L，生根培養基為 MS+IBA 0.025 ～0.05 mg/L。設計2種不同激素組合培養愈傷組織(表1)。所有培養基均附加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L，pH為5.9～6.1，120℃滅菌30～35 min。

表1 基本培養基MS中激素配比情況 mg/L

1.4 外植體的消毒 采用的外植體為芍藥的嫩芽，由于嫩芽與外界土壤直接接觸，受菌類感染的機會很大，所以消毒過程十分重要。嫩芽先用清水清洗，剝去外層的鱗片，切除基部受傷部分，用適量洗潔精浸泡15 min，再用流水沖洗20 min;然后在超靜工作臺上先用75%乙醇消毒10 s，再用0.2%HgCl2消毒 10 min，最后用無菌水沖洗多次［5］。各處理均接種5瓶。

2 結果與分析

2.1 取材和放置時間不同對莖尖組培的影響 經過2年的對比試驗結果表明，2月份取材的亳芍地下嫩芽在成活率、生長狀況均優于10月取材的地下嫩芽(表2)。2月份取材的芍藥地下嫩芽不僅污染率低于10月份取材的相同品種，且生長勢強。原因在于2月份取材的地下嫩芽經過低溫過程，休眠被低溫打破，且營養儲備時間長，芽體健壯。因此，亳芍地下嫩芽的取材應以2月份為宜，選取個體中等、尚未完全展開的地下嫩芽。

表2 取材時間對成活率的影響 %

材料放在基質中，隨著放置時間的減小，地下嫩芽污染率從65.2%降低至28.1%;褐化率從60.3%升高至85.3%;成活率從34.8%升高到71.9%(表3)。原因是隨著地下嫩芽放置時間的延長，其組織細胞失水，細胞活性降低，從而抵抗病菌的能力降低，消毒的效果也越差。所以，在相同材料的前提下，放置時間越短的植物材料成活率越高，但其褐化率也高。因此，地下嫩芽放置時間要綜合考慮污染率和褐化率，對于不同放置時間的地下嫩芽，應選擇不同的處理。放置到基質中的地下嫩芽比無處理的地下嫩芽的污染率低。材料無處理時，放置3 d后，成活率為0。由于放置到基質中的地下嫩芽鱗片之間貼合緊密，空隙少，雜菌進入幾率小;其次，健壯地下嫩芽的生理活性高，生長勢強，不易感染病菌。因此，亳州芍藥組織培養應選取生長健壯、飽滿的地下嫩芽。如果地下嫩芽輕微失水，應將芽放置于基質內，然后再進行組織培養;若地下嫩芽失水嚴重，就不能用它作為組培材料。

表3 放置時間對成活率的影響 %

2.2 芽和愈傷組織在不同時間段的生長狀況 以飽滿的地下嫩芽為接種材料，選用 MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA30.025 mg/L為誘導培養基，觀察30 d的生長情況。結果表明，前10 d芽的高度、直徑和重量變化很小;第20天及第30天時，第30天重量是第20天的2倍，芽的高度和芽體直徑增長較為明顯，芽體生長較迅速(表4，圖1)。因此，擴大培養時間應在30 d前后進行，此時間段芽體生長較旺盛，對擴大培養十分有利。

表4 培養基上芽的生長狀況

挑取芽體基部的愈傷組織接種到擴大培養基MS+BA 0.5 mg/L+NAA0.025 mg/L 中，結果表明，30 d 后，直徑從0.3 cm 增加到1.2 cm，重量從 0.1 g 增加到 1.7 g。其中第20～30天較前一階段增加明顯，增長幅度較大(表5)。說明愈傷組織在接種第20～30天生長很旺盛，擴大培養應選擇在此時間段之后。

表5 接種30 d愈傷組織的變化

當愈傷組織放置時間超過40 d時，即使沒有加入生根激素IAA，在其表面也會出現透明的根狀物(圖2)。

2.3 芍藥莖尖愈傷組織誘導擴大培養 以芽基部愈傷組織為試驗材料，選用MS為基本培養基，在不同濃度的BA、NAA中組合，分別在第10、20、30天觀察記載生長情況(表6)。結果表明，14種培養基均能完成擴大培養，但生長狀況在20 d左右時存在一定差異，隨激素濃度的增加愈傷組織逐漸增多，到達一定程度時，有下降趨勢;在只加BA、不加NAA的情形下，30 d后愈傷組織有明顯的死亡現象。G11、G12培養基上愈傷組織增殖能力強，愈傷組織生長量大，適合作為誘導擴大培養的培養基。

表6 愈傷組織在不同激素配比時的生長情況

3 討論

亳芍在組培苗培養過程中很容易受到污染，如培養基、超凈工作臺及容器等消毒過程不徹底、外植體帶菌、工作人員操作不規范等［6］。但最主要的原因是芍藥的地下嫩芽直接與土壤接觸，且有多層鱗片包裹，容易滋生一些菌類［7］。主要是細菌和真菌，細菌在接種2 d左右即可被發現;真菌在接種7 d左右才出現癥狀。因此，芽的選擇和消毒尤為重要，在實際操作中一定要認真對待。

芍藥為多年生草本植物，次生代謝旺盛，地下嫩芽內含有較多的酚類化合物，組織培養過程中外植體極易褐化［8］，這些褐色物質在培養基中不斷擴散，抑制其他酶的活性，毒害培養材料，嚴重影響組培苗的成活率、擴繁率［9－10］。該試驗結果表明，地下嫩芽在基質中放置一段時間后能夠有效地降低褐化率，但放置時間太久，會增加污染，這就形成矛盾。如何調節這一矛盾，還需要進一步研究。

針對如何把愈傷組織誘導成苗的問題，國內外專家學者進行大量研究，目前還沒有一個行之有效的解決辦法［11－12］。在試驗中發現，當愈傷組織放置時間超過40 d時，即使沒有加入生根激素IAA，其表面也會出現透明的根狀物，具體原因有待進一步研究。

［1］馬宗新，馬同富，孟冬青.亳芍莖尖組織培養的研究［J］.中國野生植物資源，2010(6):63－66.

［2］魏志華，王新民，喬卿梅，等.亳芍藥材適宜產區區劃研究［J］.北方園藝，2011(11):170－172.

［3］吳紅娟，于曉南.國內外芍藥組織培養研究進展［J］.安徽農業科學，2010(2):617－619.

［4］張慶瑞，孫建洲，任凝輝，等.芍藥組織培養技術研究［J］.河南農業科學，2006(4):88－90.

［5］董永義，宋旭，郭園.觀賞芍藥組織培養研究［J］.林業實用技術，2009(5):66.

［6］曲文靜，李青，劉燕.芍藥組織培養中地下芽污染的克服［J］.植物研究，2014(4):524－528.

［7］王吉鳳，李青，包欣.芍藥組織培養中污染現象的克服［J］.植物研究，2012(1):84－90.

［8］曲文靜.芍藥組織培養及褐化研究［D］.北京:北京林業大學，2014.

［9］王瑤.兩種芍藥愈傷組織的誘導及褐化抑制的研究［D］.哈爾濱:東北林業大學，2009.

［10］王瑤，岳樺.芍藥屬植物組織培養中褐化問題的研究進展［J］.黑龍江農業科學，2009(2):159－160.

［11］薛銀芳，趙大球，周春華，等.芍藥組織培養的研究進展［J］.北方園藝，2012(4):167－170.

［12］吳紅娟.芍藥品種地下芽誘導及愈傷組織培養研究［D］.北京:北京林業大學，2011.