糖皮質激素誘導重組轉基因二元載體pElrLEG的構建

王宏歸，黃 晨，姜 雅，嚴秋香，周春洪

(1.揚州大學環境科學與工程學院，江蘇揚州225127;2.揚州大學測試中心，江蘇揚州225009)

常見的誘導型載體有四環素類、糖皮質激素類、雌激素類、酒精類、蛻皮(Ecdysone)激素類、金屬類。這些類型的誘導載體各有優劣。四環素誘導型載體，其四環素使用量大，不僅對細胞產生毒害，而且對環境也會造成危害;雌激素誘導型載體，由于雌激素在植物體內不易擴散，局部誘導性強，因此不適宜對整株植物誘導;蛻皮激素誘導型載體，其缺點是葉片對蛻皮激素吸收差;酒精誘導型載體，其缺點:酒精對植物有毒害作用，且易揮發;銅誘導型載體，誘導素元銅對細胞有毒害作用，且其擴散有限;地塞米松是糖皮質激素誘導型表達載體的誘導劑，不僅無毒，而且可以高效地被運輸到植物的各個組織。

正因為地塞米松具有以上優點，所以糖皮質激素誘導型表達載體適合用于植物轉基因。目前研究大部分都是將GR-Cre重組酶片段和Loxp位點分別構建在2個Ti質粒的T-DNA上，要實現Loxp位點的重組，必須將2個質粒的轉基因植株進行雜交，如果將GR-Cre重組酶片段和Loxp位點同時構建在同一個載體上，那么Loxp位點的重組無需通過雜交，這樣既可以節省時間也可以減少工作量［1－3］。

由于重組酶能使Loxp位點的DNA發生重組，而DNA位于細胞核內，因此，Gre只能在細胞核內起作用。Cre與GR的融合蛋白，在不外加地塞米松時，GR-Cre通過GR結合在內質網上，DNA重組不能發生;當有地塞米松時，GR-Cre通過GR與地塞米松結合，使得GR-Cre從內質網上脫落，進入細胞核內，結合到Loxp位點上，引發重組［4－5］。在Loxp位點之間還含有一個Gateway cassette和多克隆位點(MCS)，Gateway克隆技術的優點是不受酶切位點的限制，該載體的Gateway cassette含有attR1和attR2兩個重組位點，這個位點用于克隆不同的啟動子，而多克隆位點(MCS)位于Gateway cassette的后面，用于目的基因的克隆［6］。位于loxP位點之間的DNA，將在外加地塞米松的情況下，引發DNA重組而被敲除［7－11］。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗所用菌株是DH5α 與DB3.1，DB3.1用于進行克隆或者擴繁含有Gateway片段的質粒［6］。質粒是pJawoh18-RNAi、pCre、pUC57。限制性內切酶及 T4DNA 連接酶均購自于NEB公司。PCR引物由primer5設計，PrimerSTAR TM HS Polymerase購自于TaKaRa公司。試驗中使用的引物:GR-Cre F:CGGGCTAGCATGTCCAATTTACTGACCGTACAC，R:CGG CCATGGTCATTTTTGATGAAACAGAAGCTT，2 059 bp;GatewayF:CGGCGTACGATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCT GA，CassetteR:CGGGGTACCACCACTTTGTACAAGAAAG CTG1，1 706 bp。

1.2 方法 PCR反應體系:模板DNA 0.5 μl，正反向引物(10 μmol/L)各 1 μl，10 × buffer 5 μl，dNTPs(10 mmol/μl)5 μl，DNA 聚合酶 0.5 U，加水補齊 50 μl。酶切體系:DNA 1 μg，buffer 2 μl，內切酶各加1 U，加水補齊20 μl，37 ℃酶切過夜，連接體系:載體:目的片段為 1∶3～1∶9，T4連接酶 1 U，buffer 2 μl，加水補齊 20 μl，4 ℃連接過夜。

2 結果與分析

2.1 Loxp-nos-Loxp(XhoI-SofI-Loxp-NheI-NcoI-NOS-BsiwI-KpnI-StuI-BgIII-MfeI-AatII-1xMyc-Loxp-SpeI)片段的合成 Loxp-nos-Loxp(南京金斯瑞生物科技公司合成)是以XhoI及SpeI位點克隆在pUC57載體上。該片段含有2個同向Loxp位點，NOS終止信號序列位于NcoI與BsiwI位點之間。Myc標簽用于蛋白表達檢測，多克隆位點用于克隆基因(圖1)。

2.2 工程質粒的構建 以pJawoh18-RNAi二元載體為骨架，利用XhoI及SpeI酶切位點將Loxp-nos-Loxp克隆到pJawoh18-RNAi載體上，即pElrL載體(圖2)。利用GR-Cre的引物從pCre載體［12－13］上擴增 GR-Cre片段，再利用 NheI與NcoI酶切位點，將GR-Cre克隆到pElrL載體上，即pElrLC載體(圖2)。將Gateway擴增片段，經BsiwI與KpnI酶切后并回收，并克隆至pElrLC上，即pElrLCG載體(圖2)。

3 討論

Cre是從噬菌體P1分離出來的DNA特異位點重組酶。Loxp位點是Cre識別位點，其最早也是在P1噬菌體中被發現。loxP在兩端有13個反向重復的堿基，中間核心序列是8個非回文結構的堿基，共34個堿基。Cre重組酶識別并結合在loxP位點的兩端，并從中間核心序列區將loxP切開。2個同向的loxP位點，在重組酶的作用下將2個loxP切開從而產生4個黏性末端，loxP位點之間的序列會自我連接成環，從而從基因組中環出丟失。

pElrLCG該載體的優點:①地塞米松作為誘導化學物質對植物無毒害作用，而且可以高效地被運輸到植物的各個組。②該載體可以同時使用Gateway克隆技術以及常規酶切連接克隆技術。③GR-Cre重組酶表達后，可以通過是否施加地塞米松來控制Cre的入核，從而人為控制何時把轉入的基因從基因組中刪除掉。④該載體在雜交育種中也有很大潛力，如花粉不育的性狀優良的母本，利用含有目的基因的載體即可得到花粉可育(轉基因)和花粉不育(轉入的目的基因環出丟失)的植株，這樣花粉可育的植株可以用來繁殖種子，而花粉不育的植株可以用作雜交育種的母本。⑤該載體的Myc標簽可以用于檢測轉入的基因是否表達。⑥該載體在施加地塞米松誘導后，GR-Cre進入核引發Loxp位點重組，Loxp位點之間的DNA片段從基因組里環出，由于環出的DNA片段包含了GR-Cre以及轉入的基因，而又不含有啟動子與3'末端加尾信號。因此，只要Loxp位點重組發生，GR-Cre及目的基因的轉錄即終止。總之，該載體在實現轉基因，可以選擇性地關閉/刪除目的基因。

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