恩諾沙星合成抗原免疫對(duì)小鼠肝臟轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

孫素玲，張 龍，郭 建 (安徽科技學(xué)院，安徽鳳陽233100)

恩諾沙星是人工合成的喹諾酮類藥物的第3代產(chǎn)品，為動(dòng)物專用抗菌劑。由于它具有廣譜、高效、組織穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛用于治療、預(yù)防動(dòng)物疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。但是，恩諾沙星在動(dòng)物體內(nèi)的殘留消除緩慢，殘留于食品中的恩諾沙星在高溫下不易分解［1］，長(zhǎng)期食用會(huì)危害人體健康。歐盟(EC)、WHO和我國(guó)等都制定了動(dòng)物性食品中恩諾沙星的最高殘留限量(MRL)［2-3］，并加強(qiáng)了對(duì)該藥在動(dòng)物性食品中殘留的檢測(cè)和監(jiān)督。

目前，肉食品中恩諾沙星殘留的檢測(cè)方法有微生物法、色譜分析法和免疫分析法等，其中免疫分析法具有較高的專一性和靈敏度，是一種很有前途的藥物殘留快速檢測(cè)方法。恩諾沙星抗體的制備是建立恩諾沙星殘留免疫學(xué)檢測(cè)方法的關(guān)鍵性步驟，嚴(yán)重影響恩諾沙星殘留免疫分析法的檢測(cè)效果。目前，關(guān)于恩諾沙星合成抗原的制備與鑒定［4］、恩諾沙星抗體的制備報(bào)道很多［5-8］，但尚未見到關(guān)于恩諾沙星合成抗原免疫對(duì)動(dòng)物機(jī)體影響的報(bào)道，為此，筆者研究了恩諾沙星合成抗原免疫對(duì)小鼠肝臟轉(zhuǎn)氨酶活性的影響，以期為評(píng)價(jià)恩諾沙星合成抗原免疫對(duì)動(dòng)物機(jī)體的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物。成年健康的昆明種小鼠20只，體重20～25 g，清潔級(jí)，由安徽科技學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，觀察飼養(yǎng)1周。

1.1.2 器材。DY89-1型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)，為寧波新芝科器研究所產(chǎn)品;JB-1A攪拌器(雷磁)，為上海夢(mèng)漢實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;L216G臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，為上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;S53型紫外可見光分光光度計(jì)，為上海棱光技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑。卡介苗，購(gòu)自上海生物制品研究所;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。恩諾沙星 (含量99.9%)，購(gòu)自江西快康動(dòng)物保健品有限公司。福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑由安徽科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)試驗(yàn)室自行配制。恩諾沙星抗原由安徽科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室自行合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物免疫。20只小鼠隨機(jī)分為2組，每組10只。試驗(yàn)組，兩側(cè)腹部皮下分點(diǎn)注射含福氏完全佐劑的抗原乳劑2 ml/只，此后每隔2周注射含福氏不完全佐劑抗原乳劑1 ml/只，共免疫4次;對(duì)照組，注射同劑量的滅菌生理鹽水。試驗(yàn)期間，2組管理?xiàng)l件相同。

1.2.2 檢樣的采集與處理。最后1次免疫后10 d，停食24 h，不停水。頸椎脫臼處死，剖開腹腔取出肝臟。參照參考文獻(xiàn)［9］的方法，制備肝組織勻漿。

1.2.3 肝組織勻漿中蛋白含量的測(cè)定(雙縮脲法)。參照文獻(xiàn)［10］的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的繪制，并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。根據(jù)樣本的吸光度和回歸方程，計(jì)算出肝組織勻漿中蛋白含量。

1.2.4 AST活性和ALT活性的測(cè)定。

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，以各管吸光度值減去零管吸光度值的差值為Y軸，以相應(yīng)的卡門氏單位為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得相應(yīng)回歸方程。

1.2.4.2 AST活性和ALT活性的測(cè)定。按照試劑盒說明書操作，將測(cè)定管吸光度值減去對(duì)照管吸光度值之差代入回歸方程求出相應(yīng)的AST/ALT活性卡門氏單位。根據(jù)AST/ALT活性卡門氏單位和組織勻漿蛋白質(zhì)含量，按照以下公式計(jì)算出肝臟組織AST/ALT活性:

肝臟組織中AST/ALT活性(U/mg prot)=肝臟組織勻漿AST/ALT活性卡門氏單位/肝臟組織勻漿蛋白含量(mg prot/ml)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)分析差異顯著性，P＜0.05表示差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝組織勻漿中的蛋白含量 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的吸光度值，計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的回歸方程為:

式中，Y為蛋白質(zhì)含量，X為吸光度。

根據(jù)樣本的吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。

2.2 肝組織勻漿中AST活性和ALT活性

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。根據(jù)AST標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，得出AST的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:

根據(jù)ALT標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度，計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:

2.2.2 肝組織勻漿中AST和ALT活性。將樣本的吸光度值分別代入式(2)和(3)，計(jì)算出的樣本AST和ALT活性卡門氏單位。然后，再計(jì)算出樣本 AST活性和ALT活性(表1～2)。

表1 各樣本的蛋白含量和AST活性

2.3 恩諾沙星免疫對(duì)AST和ALT活性的影響 由表3可知，試驗(yàn)組肝臟組織AST活性略有降低，但與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)，因此恩諾沙星免疫小鼠對(duì)肝臟組織AST活性沒有明顯影響。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠肝臟微粒體中ALT活性明顯降低，差異極顯著(P＜0.01)。

3 討論

ALT和AST是目前最常用的肝功能檢測(cè)指標(biāo)。ALT主要存在于肝臟、心臟和骨骼肌中。AST在心肌細(xì)胞中含量最高，其次為肝臟。因此，筆者選擇了肝臟組織勻漿作為檢樣。該試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組肝臟組織AST活性略有降低，但與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)。這說明肝細(xì)胞的線粒體仍保持完整，因?yàn)楦蝺?nèi)的AST有2種同工酶，sAST分布于肝細(xì)胞漿內(nèi)，mAST分布于肝細(xì)胞線粒體中，AST只有1/5存在于肝細(xì)胞漿中，約有4/5在線粒體。該試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠肝臟微粒體中ALT活性明顯降低，差異極顯著(P＜0.01)，說明用恩諾沙星合成抗原對(duì)小鼠進(jìn)行4次免疫會(huì)損傷肝細(xì)胞，因?yàn)锳LT主要分布在肝細(xì)胞漿內(nèi)，雖然ALT也有可溶性胞漿ALT(s-ALT)和線粒體ALT(m-ALT)2種同工酶，但以s-ALT為主，m-ALT僅占小部分。

表2 各樣本的蛋白含量和ALT活性

表3 恩諾沙星合成免疫對(duì)肝臟組織轉(zhuǎn)氨酶活性的影響(±s)

表3 恩諾沙星合成免疫對(duì)肝臟組織轉(zhuǎn)氨酶活性的影響(±s)

注:＊＊表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P＜0.01)。

組別 AST活性∥U/mg prot ALT活性∥U/mg prot對(duì)照組384.34 ±74.06 934.92 ±117.94試驗(yàn)組 358.04 ±48.63 523.78 ±94.64＊＊

該試驗(yàn)中對(duì)照組AST/ALT的比值為0.41，試驗(yàn)組AST/ALT的比值為0.68，試驗(yàn)組AST/ALT的比值有所提高，但都低于1，也說明用恩諾沙星合成抗原對(duì)小鼠進(jìn)行4次免疫會(huì)損傷肝細(xì)胞，但肝細(xì)胞的線粒體仍保持完整。

4 結(jié)論

恩諾沙星合成抗原免疫對(duì)小鼠肝臟組織ALT活性有抑制作用，但對(duì)AST活性沒有明顯影響。筆者只測(cè)定了肝臟組織勻漿中ALT和AST活性，未進(jìn)行肝臟組織微觀上的病理變化觀察，其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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［3］農(nóng)業(yè)部公告2002第235號(hào):動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量［S］.2002.

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［8］趙銀麗，王建華，王自良，等.抗恩諾沙星單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的篩選及競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒的研制［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，22(6):898-903.

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