超聲輔助酶法提取胡椒堿的工藝優化

劉 笑，侯順超，顧 林(揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州225000)

胡椒(Piper nigrum L)，始載于唐朝蘇恭的《唐木草》，又名白川、浮椒，是胡椒科胡椒屬常綠藤本植物［1－2］。原產于印度，被稱為“熱帶香料之王”，西漢時期傳入我國(《后漢書·天絲傳》)，如今已成為我國海南的特色產業［3］。根據果實的成熟程度胡椒有黑白之分，黑胡椒粒大飽滿、氣味濃烈、色黑皮皺，手感質地較白胡椒略輕，但氣味更為辛辣［4］。隨著2003年衛生部批準胡椒油樹脂、胡椒油為食品添加劑新品種［5］，胡椒堿作為胡椒中主要的生物活性物質，倍受關注，近年來成為保健產品開發的新資源。胡椒堿具有抗炎［6］、抑菌［7］、抗氧化［8］、降血脂［9］等活性，對抑郁癥［10］、心肌缺血［11］、白癜風等色素脫失性皮膚病［12］有一定的療效，更有潛力被開發為新的抗癌藥物［13－14］。

目前，胡椒堿的提取方法主要有酸水提取法［15］、有機溶劑浸提法(回流法和索氏提取法)［16］、超聲波輔助法［17］、超臨界流體萃取法［18－19］和微波減壓蒸餾法［20－21］等。由于胡椒堿難溶于水，故酸水提取法提取率低;與傳統的有機溶劑萃取法相比，超臨界流體萃取具有快速、高效、樣品用量少、幾乎無溶劑殘留及操作條件溫和的特點，但該法設備投資大，技術要求高;微波輔助法簡單可靠，對于胡椒堿的提取還有待進一步深入系統化;而超聲法是目前儀器輔助萃取中最為常用的方法，時間短、效率高，且溶劑用量少［22］。近年來，采用超聲輔助酶法提取植物中活性成分的研究已有些許成效，國內外對胡椒堿的提取研究也不少，但采用超聲輔助酶法提取胡椒堿的工藝研究尚未報道。筆者通過研究超聲輔助酶法提取黑胡椒中胡椒堿的影響因素，采用響應面分析法優化工藝條件，從而提高胡椒堿提取率，更好地開發胡椒資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑。黑胡椒購于海南儋州市;纖維素酶(30 U/mg)，上海藍季科技發展有限公司;磷酸氫二鈉、檸檬酸，天津市科密歐化學試劑有限公司;胡椒堿標準品(98%)，天津一方科技有限公司;無水乙醇(分析純)，上海蘇懿化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備。數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司;RE-52AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ⅲ循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫療器械有限公司;紫外分光光度計，上海欣茂儀器有限公司;KQ-200KDE型高功率數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理［23］。稱取適量黑胡椒置于50℃烘箱中恒溫干燥48 h，粉碎并過100目篩，得到黑胡椒粉備用。

1.2.2 樣品提取及其含量測定。準確稱取3.000 g黑胡椒粉和一定量酶于250 ml錐形瓶中，加入一定pH的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液60 ml，置于恒溫水浴鍋中浸泡后超聲，提取液抽濾，濾液旋轉蒸發至干，加入適量無水乙醇溶解保存;濾渣烘干后于250 ml錐形瓶中，加入60 ml無水乙醇浸泡，暗處靜置1 h，超聲提取后抽濾，得到濾液，將2次濾液合并搖勻，即為胡椒堿提取液，于波長342 nm處測吸光度，代入標準曲線方程計算出胡椒堿含量，從而得到胡椒堿提取率。

超聲輔助酶法提取胡椒堿的工藝流程如圖1。

1.2.3 標準曲線的制備。準確稱取15mg胡椒堿標品，無水乙醇定容至100 ml，分別取200、400、600、800、1 000、1 200、1 400 μl于25 ml容量瓶中，無水乙醇定容，得到濃度分別為1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2、8.4 mg/L 的胡椒堿醇溶液，以無水乙醇作參比，于波長342 nm處測吸光度，繪制標準曲線，如圖2所示。

1.2.4 單因素試驗設計。對酶量、緩沖液pH、超聲時間及酶解溫度4個因素進行單因素試驗，考察它們對提取胡椒堿的影響。

1.2.5 響應面試驗設計［24］。在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計原理，以胡椒堿提取率為響應值，設計酶量(A)、緩沖液pH(B)、酶解溫度(C)3因素3水平響應面分析試驗。各因素水平編碼值見表1。

表1 響應面分析因素及水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 酶量對胡椒堿得率的影響。準確稱取3.000 g胡椒粉于250 ml錐形瓶中，分別加入 3、6、9、12、15 mg 纖維素酶，60 ml pH 6的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液攪勻，置于40℃恒溫水浴鍋中浸泡后40℃下超聲50 min，抽濾，濾液旋轉蒸發至干，加入適量無水乙醇溶解并保存;濾渣烘干后于250 ml錐形瓶中，加入60 ml無水乙醇浸泡，暗處靜置1 h，超聲提取1 h后抽濾，得到濾液，將2次濾液合并搖勻，冷卻后測吸光度，計算提取率，試驗結果見圖3。

由圖3可以看出，纖維素酶的用量對胡椒堿提取有一定的影響，隨著酶量的增加，胡椒堿的提取率呈明顯上升趨勢，當酶量增至12 mg時，胡椒堿提取率達到最大，再增加酶量，提取率顯著降低。這可能是由于體系中底物濃度一定，酶濃度的增大，增加了酶與底物接觸機會，同一時間內水解的分子數不斷增加，致使更多成分分離出來，但是當酶濃度升高到一定程度，酶分子過于飽和，一部分酶將沒有機會與底物結合，底物被水解的速度變慢，提取率就下降，因此試驗確定酶量為12 mg。

2.1.2 緩沖液pH對胡椒堿提取率的影響。在纖維素酶用量12mg，超聲時間50min、酶解溫度40℃的條件下進行提取，具體操作同“2.1.1”，考察磷酸氫二鈉 －檸檬酸緩沖液pH(3、4、5、6、7)對胡椒堿提取率的影響，試驗結果見圖4。

由圖4可以看出，隨著緩沖液pH的增大，胡椒堿提取率迅速增加，在pH 4時達到最大，此后增大pH，胡椒堿提取率逐漸降低。這可能是由于過高或者過低的pH會影響酶蛋白構象，使酶部分變性或失活，從而影響酶活力。pH為4時處于最適酸度，酶活性和催化效果最高，提取效果達到最佳，因此試驗選取最適pH為4。

2.1.3 超聲時間對胡椒堿提取率的影響。在纖維素酶用量12 mg，緩沖液pH 4、酶解溫度40℃的條件下進行提取，具體操作同“2.1.1”，考察超聲時間(20、35、50、65、80 min)對胡椒堿提取率的影響，試驗結果見圖5。

由圖5可以看出，隨著溫度的升高，胡椒堿提取率也隨之增加，當超聲時間延長至50 min時，提取率最高，此后趨于平緩，甚至略有減少。這可能是由于長時間超聲提取會導致胡椒堿中某些不穩定的成分氧化分解，從而造成提取率的下降，且考慮到生產周期，試驗確定超聲時間為50 min。

2.1.4 酶解溫度對胡椒堿提取率的影響。在纖維素酶用量12 mg，緩沖液pH 4、超聲時間50 min的條件下進行提取，具體操作同“2.1.1”，考察酶解溫度(30、35、40、45、50 ℃)對胡椒堿提取率的影響，試驗結果見圖6。

由圖6可以看出，胡椒堿提取率隨著酶解溫度的升高而增大，溫度達到40℃后，繼續升高溫度，并不能明顯提高胡椒堿提取率。這可能是因為隨著溫度的升高，酶活性增加，反應速度加快，但超過最適溫度后，酶蛋白開始變性，酶的活性受到破壞甚至失活，影響到胡椒堿的提取。故該試驗選擇40℃為最佳提取時間。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 胡椒油樹脂提取工藝優化試驗設計與結果。根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken中心組合試驗設計原理，選取酶量(A)、緩沖液pH(B)和酶解溫度(C)為試驗因素，以胡椒堿提取率為響應值，超聲時間50 min，進行3因素3水平響應面優化試驗。響應面試驗設計及結果見表2。

利用Design Expert 8.05軟件對表2數據進行分析，得到胡椒堿對3個因素的二次多元回歸方程:Y=5.689+0.152 625A+0.086 125B+0.013 25C+0.002 5AB －0.026 75AC+0.044 25BC － 0.380 75A2－ 0.153 25B2－0.059 5C2。

2.2.2 回歸模型的方差分析。對試驗數據進行方差分析可得:F模型=52.818 06，P模型=0.000 2＊＊;FA=103.989 9，PA=0.000 2＊＊;FB=33.112 99，PB=0.000 2＊＊;FC=0.783 739，PC=0.416 5;FAB=0.013 951，PAB=0.910 6;FAC=1.597 193，PAC=0.262 0;FBC=4.370 553，PBC=0.090 8;FA2=

表2 響應面試驗設計與結果

由此可以看出，該模型 P=0.000 2 ＜0.01，高度顯著，失擬誤差P=0.065 9＞0.05，不顯著，說明該模型有效。一次項A、B、C均達到高度顯著水平;3個因素交互項都不顯著;二次項A2、B2高度顯著，C2顯著。由3個影響因素的F值大小可知，3個因素對胡椒堿提取率影響大小的排序為:酶量＞緩沖液pH ＞酶解溫度。同時，決定系數R2=0.989 591，表明該方程擬合程度較好，試驗誤差較小，可以用來分析和預測黑胡椒中胡椒堿提取率的變化。

2.2.3 響應面分析與工藝優化。根據上述結果繪制模型方程的響應曲面和等高線圖，各因素的交互作用見圖7。由圖7可知，酶量對胡椒堿提取率的影響最為顯著，其次是緩沖液pH，3個因素之間交互作用都不顯著。

由響應面軟件分析可知，在酶量 12.59 mg，pH 4.31，酶解溫度40.91℃的條件下，胡椒堿提取率最大，可達5.718 39%。為了驗證響應面法的可行性，并考慮到實際操作，在酶量12.6 mg，pH 4.31，酶解溫度 41 ℃，超聲時間 50 min的條件下進行3次驗證試驗，得到提取率的平均值為5.624%，與理論值5.718 39%較接近，可見該模型準確可靠，利用該模型在實踐中進行預測是可行的。

3 結論

超聲輔助酶法提取黑胡椒中胡椒堿，并采用響應面法對其工藝進行優化。單因素試驗和響應面優化結果表明，影響胡椒堿提取率的工藝因素按主次順序排列:酶量＞緩沖液pH＞酶解溫度;超聲輔助酶法提取胡椒堿的最佳工藝參數為酶量 12.6 mg，pH 4.31，酶解溫度41 ℃，超聲時間 50 min，此條件下胡椒堿的提取率為5.624%，可為胡椒的深加工提供一些理論依據。

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