姜黃素抑制小膠質細胞NADPH氧化酶保護多巴胺能細胞的機制研究

崔群力鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州 450014

姜黃素抑制小膠質細胞NADPH氧化酶保護多巴胺能細胞的機制研究

崔群力
鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州 450014

目的 探討小膠質細胞在多巴胺能細胞損傷中的作用，以及姜黃素通過抑制小膠質細胞反應保護多巴胺能細胞的機制。方法 選用大鼠嗜鉻細胞瘤株PC12細胞，用魚藤酮誘導其損傷建立帕金森病細胞模型；用姜黃素預處理4h的BV-2細胞再經魚藤酮處理4h后的細胞上清液作為條件培養液（microglia conditioned medium with curcumin，MCMC），處理PC12細胞。應用四甲基偶氮唑鹽法（MTT法）檢測細胞活力；DCFH-DA染色檢測BV-2細胞內活性氧類物質（ROS）的水平；Western blotting法檢測NADPH氧化酶P47-phox亞基在BV-2細胞膜上的表達。結果 與對照組相比，經姜黃素預處理的BV-2細胞ROS水平降低（P＜0.01）；受MCMC處理的PC12細胞活力增加（P＜0.01）。姜黃素預處理使結合到BV-2細胞膜的NADPH氧化酶P47-phox亞基明顯降低（P＜0.05）。結論 魚藤酮通過激活小膠質細胞內NADPH氧化酶產生ROS，損傷多巴胺能細胞。姜黃素能夠抑制小膠質細胞內NADPH氧化酶的激活，減少ROS的產生，進而保護多巴胺能細胞。

姜黃素；魚藤酮；PC12細胞；條件培養液；小膠質細胞；NADPH氧化酶

既往多從多巴胺能神經元的角度探索帕金森病（PD）的發病機制，自從在PD患者和動物模型腦組織中發現黑質致密部不僅有大量多巴胺能神經元缺失，還有膠質細胞的增生［1］，炎癥反應在PD發病中的作用日益受到重視。小膠質細胞是中樞神經系統中的免疫細胞，通過分泌具有神經毒性的ROS在PD中產生致病作用［2］。因此，抑制小角質細胞過度激活所介導的炎癥反應可能代表了PD治療的一個研究方向。

姜黃素是食用姜黃的主要成分，具有抗炎、抗氧化作用，能夠調節和抑制小膠質細胞的表達和遷移［3］。為此，我們采用鼠神經生長因子誘導過的PC12細胞作為細胞模型，用魚藤酮作用于BV-2細胞后，含有炎性細胞因子的條件培養液處理PC12細胞，觀察PC12細胞的存活率及凋亡，探討小膠質細胞激活后對多巴胺能神經細胞的影響，研究姜黃素抑制小膠質細胞激活及保護多巴胺能細胞的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器 姜黃素、魚藤酮、購自美國Sigma公司；其余試劑為國產分析純。PC12細胞在高糖DMEM培養基中培養，內含10％胎牛血清。在通有5％ CO2、37℃的培養箱中培養，隔天換液1次。細胞豐度達70％～80％時傳代1次，并于細胞豐度達70％～80％時進行試驗。BV-2細胞在含10％胎牛血清的高糖DMEM培養基中培養。在體積分數為5％CO2、37℃的培養箱中培養，隔天換液1次。細胞豐度達70％～80％時傳代1次，并于試驗前更換培養基。

條件培養液處理PC12細胞：姜黃素預處理BV-2細胞4h加入10nmol/L終濃度的魚藤酮共孵育6h，收集培養上清，作為PC12細胞的條件培養液（microglia conditioned medium with curcumin，MCMC）。實驗前更換PC12細胞的培養基，將條件培養液加入PC12細胞繼續培養。細胞培養后24h觀察細胞存活率及凋亡情況。

1.2 噻唑藍（MTT）比色法檢測PC12細胞活力 將細胞濃度1×108～1×109L-1的PC12細胞，按1×104～1×105個細胞/孔接種（每孔加細胞懸液90μL）于96孔培養板，每組6個復孔。另設調零孔不接種細胞，只加培養基，其他條件相同。魚藤酮組分別加入適量的魚藤酮稀釋液（每孔10μL），使其終濃度為10nmol/L；姜黃素預處組組（姜黃素藥物終濃度分別為0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L預處理4h后，與魚藤酮終濃度10nmol/L共孵育BV-2細胞6h，收集培養液作為PC12細胞的條件培養液）4組，共6組，共孵育6h，對照組不加任何藥物（每孔終體積100μL）。孵育24h后每孔加入10μL MTT（5mg/mL），37℃，繼續孵育4h，加入100μL DMSO，振蕩10min至甲月贊顆粒充分溶解，在570nm波長下用酶標儀測定各孔OD值。

1.3 DCGH-DA染色法檢測BV-2細胞內活性氧類物質（ROS）水平 DCFH-DA（2＇-7＇-二氯熒光乙酰乙酸鹽）是一種能自由通過細胞膜染色劑，其本身不發出熒光，當被細胞內ROS氧化為熒光化合物DCF時便發出熒光。通過檢測DCF的熒光強度，反映細胞內ROS的水平。

分組及藥物處理：姜黃素預處理組（0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）4組；魚藤酮組；空白對照組，共6組。按要求加入姜黃素使其終濃度為0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L預處理4h后，加入魚藤酮終濃度為10nmol/L，空白對照組不加任何藥物培養基培養，置37℃5％CO2細胞培養箱培養24h。按照試劑盒說明書操作，收集細胞。進行流式細胞儀檢測：波長488nm氬離子激光，觀察50 000個細胞以上——波峰右移，表明活性氧（ROS）含量高。

1.4 Western blotting法檢測BV-2胞膜NADPH氧化酶的表達 實驗分組及藥物處理：按要求將BV-2分：胞漿蛋白對照組；膜蛋白對照組；以上2組不加任何藥物；姜黃素預處理組（0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L）3組；魚藤酮對照組組；apocynin對照組，共7組。不同濃度姜黃素或apocynin（1mmol/L）預處理4h后按要求加魚藤酮至終濃度10 nmol/L共孵育24h后搜集細胞。

細胞裂解提取膜蛋白（采用天然膜蛋白抽提試劑盒ProteoExtract（M-PEK），MERCK，Cat.No：444810）：膜蛋白對照組；姜黃素預處理組（0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L）3組；魚藤酮對照組組；apocynin對照組，以上6組進行提取胞膜蛋白。細胞裂解分離提取漿/核蛋白（采用天然漿/核蛋白分離抽提試劑盒NucBuster Protein Exaction Kit，MERCK，Cat.No：71183-3）：胞漿蛋白對照組BV-2細胞進行提取胞漿蛋白。SDS-PAGE電泳：每泳道加總蛋白20μg進行SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移至PVDF膜上，用5％脫脂奶粉TBST液浸泡3h，Ⅰ抗孵育4℃過夜（抗體稀釋度1∶500），用TBST液洗膜5min×3次，與辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（抗體稀釋度1∶2 000）室溫下孵育1h，用TBST液洗膜5min×3次，將膜放在1mL ECL發光試劑混合液中孵育約1min，吸掉混合液，保鮮膜固定，X線膠片曝光1～10min，顯影、定影。定影及DAB顯色，將反應的顯影條帶掃描，圖像保存入計算機，用Bandscan 5.0軟件對圖像進行分析。

1.5 統計學處理 數據由SPSS 13.0軟件進行統計學分析，檢測結果采用均數±標準差（±s）表示，多組數據間比較采用單因素方差分析，2組數據間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT檢測條件培養液對PC12細胞增殖活力的影響 魚藤酮組與對照組比較，PC12細胞活力顯著降低（P＜0.01）；姜黃素預處理的條件培養液使PC12細胞活力增加，與魚藤酮組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。如圖1示。

圖1 條件培養液對PC12細胞活力的影響

2.2 DCGH-DA染色法檢測BV-2細胞內活性氧類物質（ROS）水平 以DCFH-DA熒光強度反映ROS水平，空白對照組細胞的ROS水平為（100±9.39）％，應用魚藤酮10nmol/L處理24h后，可使細胞內產生大量的活性氧，熒光強度增加，細胞ROS水平升至對照組的（187.9±20.5）％，差異有極顯著統計學意義（P＜0.01）。姜黃素預處理4h后和10nmol/L魚藤酮共同孵育24h，可拮抗ROS的生成，熒光強度明顯降低，其中1.0μmol/L和5.0μmol/L姜黃素的抑制作用最強。與空白對照組相比，上述各濃度姜黃素預處理組細胞ROS水平分別為對照組的（187.9±20.5）％、（142.9±15.1）％、（137.1±17.6）％和（151.0±16.8）％。0.5μmol/L姜黃素組與魚藤酮組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；1.0μmol/L、5.0μmol/L、10μmol/L姜黃素組與魚藤酮組比較差異有極顯著統計學意義（P＜0.01）。

2.3 Western blotting法檢測BV-2細胞胞膜NADPH氧化酶p47phox亞基的轉移率 膜蛋白對照組：BV-2細胞胞膜NADPH氧化酶p47phox亞基處于很低水平；魚藤酮組：魚藤酮誘導后，NADPH氧化酶p47phox亞基向胞膜轉移，BV-2細胞胞膜NADPH氧化酶p47phox亞基處于較高水平，與膜蛋白對照組比較差異有極顯著統計學意義（P＜0.01）；姜黃素預處理和NADPH氧化酶抑制劑（apocynin）均顯著抑制了NADPH氧化酶p47phox亞基向細胞膜的轉移，從而抑制了BV-2細胞NADPH氧化酶的活性，其中以5.0μmol/L姜黃素抑制作用最強，與魚藤酮組比較差異有極顯著統計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 姜黃素對魚藤酮誘導的BV-2細胞NADPH氧化酶轉移率的影響

3 討論

PD是一種神經變性疾病，以中腦黑質多巴胺能神經元進行性丟失為特征。近年來的研究認為，炎癥反應是神經系統變性疾病共有的重要特征。在炎癥反應過程中，小膠質細胞是關鍵因素。小膠質細胞與炎癥反應和神經毒性有密切關系。目前認為，小膠質細胞的過度激活導致了神經變性疾病的慢性進展、是PD進行性發展的驅動力［4］。小膠質細胞內含有NADPH氧化酶，其在炎癥和神經變性間起重要作用。小膠質細胞通過NADPH氧化酶產生大量自由基，NADPH氧化酶可能是小膠質細胞源性ROS的原始來源和小膠質細胞內促發炎癥信息的一個重要機制。當小膠質細胞被激活時，NADPH氧化酶胞質亞基p47磷酸化后同p67、p40和Rac2結合轉移到胞膜，同結合與胞膜的亞基細胞色素b558相結合，從而裝配成具有活性的酶，催化產生細胞外過氧化物［5］。NADPH氧化酶不僅產生小膠質細胞外ROS，也是小膠質細胞信息系統的重要成分，調節小膠質細胞幾種炎癥介質的表達。因此，阻斷或抑制小膠質細胞介導的炎癥反應，進而阻斷炎癥反應介導的神經元損傷，從而減緩神經變性疾病的進展可能是神經變性疾病的一個治療方向。

姜黃素具有抗氧化、抗炎作用，能夠保護由MPP+、MPTP、6-羥多巴胺誘導的神經變性；能通過NF-κB信號通路抑制炎癥因子的轉錄而發揮抗炎作用［6］。為此，我們采用姜黃素預處理BV-2細胞觀察魚藤酮誘導的小膠質細胞炎癥反應及對PC12細胞的影響。研究結果顯示，0.5～10μmol/L姜黃素條件培養液組較魚藤酮組PC12細胞活力明顯增強，1.0μmol/L和5.0μmol/L的姜黃素條件培養液對PC12細胞活力影響最顯著（P＜0.01）。因魚藤酮是細胞線粒體復合物Ⅰ抑制劑，其抑制線粒體對氧的利用，從而產生大量ROS。另有文獻［7］報道，魚藤酮可激活BV-2細胞內NADPH氧化酶。因此，我們推測姜黃素可能通過直接清除BV-2細胞內ROS、抑制魚藤酮誘導的BV-2細胞內NADPH氧化酶的激活抑制ROS的產生，從而發揮保護多巴胺細胞的作用。于是，我們測定了BV-2細胞內的ROS，結果顯示，姜黃素明顯減少了魚藤酮誘導的BV-2細胞內的ROS的含量，以1.0μmol/L和5.0μmol/L姜黃素作用最強（P＜0.01）。我們分析，BV-2細胞內ROS的來源可能有：魚藤酮抑制線粒體呼吸鏈利用氧而產生；通過NADPH氧化酶的激活途徑產生；釋放到BV-2細胞外的ROS向細胞內滲漏或通過胞吞作用進入細胞內。而BV-2細胞內ROS的增多又作為刺激因素激活NADPH氧化酶或促使BV-2細胞釋放其他炎癥介質［8］，進而形成惡性循環。為此，我們進一步檢測了NADPH氧化酶的活性。結果顯示，同NADPH氧化酶抑制劑apocynin一樣，姜黃素也顯著抑制了魚藤酮誘導的BV-2胞質內p47phox亞基向細胞膜的轉移，以5.0μmol/L姜黃素的作用最強（P＜0.01），從而減少BV-2細胞外和細胞內ROS的產生，保護多巴胺能細胞。

本研究證實，小膠質細胞介導的炎癥反應加重了魚藤酮對多巴胺能細胞的損傷；姜黃素通過抑制小膠質細胞NADPH氧化酶的激活，減少了小膠質細胞源性ROS的生成，及直接清除細胞內ROS，阻斷小膠質細胞激活的惡性循環，從而保護多巴胺能細胞。

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（收稿2014-07-12）

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A

1673-5110（2015）11-0037-03