腦創傷模型大鼠腦組織中SBDP145和SBDP120的水平測定

黃 銳

湖北襄陽市中醫院神經外科 襄陽 441000

腦創傷模型大鼠腦組織中SBDP145和SBDP120的水平測定

黃 銳

湖北襄陽市中醫院神經外科 襄陽 441000

目的 檢測大鼠重型顱腦損傷模型腦組織中SBDP140和SBDP120濃度，分析其在創傷急性期釋放趨勢。方法

創傷性腦損傷；SBDPS

αII-spectrin大量存在于在神經元的軸突和突觸前末梢，能夠被calpain分解為SBDP150和SBDP145，被caspase-3分解為SBDP120。由于calpain和caspase-3是腦缺血和腦損傷發生時促進細胞凋亡壞死的重要因子［1］，因此SBDPS（αII-spectrin break down Products）可能與顱腦損傷造成的腦細胞損害存在著聯系，可以成為一種腦損傷的標志物。本研究檢測了大鼠重型顱腦損傷CSF中SBDP145和SBDP120濃度，分析其在創傷急性期釋放趨勢。

1 資料和方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年雄性SD大鼠70只（湖北省實驗動物中心提供），體質量250～300g，隨機分為對照組（假手術組）10只，實驗組（重型腦損傷組）60只。

1.2 大鼠腦挫裂傷模型制作方法 以氯胺酮按照60mg/kg腹腔內注射麻醉大鼠后，大鼠腦立體定位儀固定大鼠頭部，剪去頂部皮毛，消毒皮膚后，正中切開頂部頭皮，剝離骨膜顯露左頂骨，于中線左側旁開約3mm，前囪后約2mm處用開直徑5mm圓形骨窗，保持硬膜完整。采用自由落體打擊裝置，以40g砝碼于25cm高處通過金屬導桿落下，撞擊置于硬腦膜上的圓錐上致重型腦挫裂傷，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。

1.3 標本制備 分別于模型制作成功后6h、12h、24h、48 h、72h、120h迅速斷頭處死小鼠，各時間點處死10只，制備腦組織勻漿，取挫傷的大腦組織（去除小腦和延髓部分），稱重后移入玻璃勻漿管中，加入9倍體積的預冷生理鹽水，4℃條件下充分研碎勻漿，制備10％勻漿，離心機4 000rpm離心10min，取上清液，-80℃凍儲存。

1.4 檢測方法 所有標本均采用酶聯免疫吸附劑測定分析方法ELSISA的方法進行檢測，用抗大鼠SBDP145、SBDP120單抗分別包被于酶標板上，標準品和樣品中的SBDP145、SBDP120與單抗結合，加入生物素化的抗人SBDP145、SBDP120形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液，在450nm處測OD值，SBDP145、SBDP120濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中SBDP145、SBDP120濃度。

1.5 統計學分析 所有數據分析均使用SPSS 17.0，計量資料以均數±標準差表示，比較Mann-Whitney檢驗，2組或3組間的數值比較采用Kruskal-Wallis檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

本次研究共包括60只重型顱腦損傷大鼠模型作為實驗組，10只假手術模型作為對照組，實驗組所有患者SBDP145 和SBDP120的平均濃度明顯高于對照組（P＜0.05）（表1）。SBDP145的釋放方式明顯不同于SBDP120，SBDP145在傷后6h就能夠檢測到明顯的變化，而SBDP120在傷后在其變化不明顯，直到到傷后72h達到峰值（圖1）。

表1 實驗組各時間點和對照組SBDP145和SBDP120的濃度比較（ng/mL）

圖1 實驗組各時間點和對照組SBDP145 和SBDP120的濃度曲線

3 討論

目前，在創傷性腦損傷發生早期對創傷的嚴重性和預后進行預測，仍沒有十分確切的辦法，臨床中經常應用的一些措施如GCS評分等，雖然應用多年，且經過很多臨床試驗的研究檢驗，但仍有一些局限性。近年來，幾種膠質細胞或神經元合成的蛋白被認為可以作為中樞神經細胞損傷的標記物，但沒有臨床應用的充分證據，這些標志物如NSE、S100、UCH-L1等，NSE被認為可以用來評估腦細胞的損害，但代謝時間較長，難以評估原發性損傷的程度，且難以區分原發性和繼發性損傷，且受到血細胞溶血的影響。S100研究較充分，并且與GCS評分和神經影像學表現相關性較高，然而其特異性不高，當其他部位出現損傷時其表達仍然增多［2］。最近的研究表明UCH-L1在重型顱腦損傷患者的CSF中濃度明顯增高，而且與腦損傷程度GCS、CT、6周內的致死率有相關［3］。

許多研究者認為出現創傷性腦損傷時，SBDPS可以作為一種潛在的標志物，Brophy等人［6］進行了腦脊液的動力學分析，認為在創傷性腦損傷急性期與caspase-3相比calpain介導的細胞凋亡可能起更重要的作用。因此SBDPS不僅在腦損傷程度方面能夠提供重要的信息，而且能夠解釋腦細胞凋亡壞死相關的病理損傷機制，本次研究通過ELISA的方法進一步證實在創傷性腦損傷的病理變化過程中，calpain和caspase-3介導的蛋白水解作用其重要的作用，而且SBDPS表現的表達水平持續的增高的現象對腦損傷的程度的評估有很大的幫助。Farkas等人的研究中［4］，發現腦脊液中的SBDPS的濃度在腦外傷患者中明顯高于對照組，Pineda等［1］的研究也發現在腦脊液中SBDP145的釋放形式不同于SBDP120，在我們的研究中，SBDP145的最大峰值出現在傷后6 h，而持續時間長，降低緩慢，直到傷后5d，而SBDP120則在傷后的濃度變化較慢，在傷后3d到達峰值，這種現象意味著，在傷后5d內細胞凋亡和壞死的機制以不同的形式被激活。αII-spectrin大量存在于軸突和突觸前末梢，而軸突是容易受到機械性損傷的影響，McCracken等的研究表明［5］，在創傷性腦損傷的患者中，傷后軸突的遲發性損害可能是由于蛋白水解酶介導的細胞結構的破壞，盡管一定數量的軸索在創傷發生時已經斷離（原發性損傷），但更多的損傷是有繼發性損害造成的，而且是不可逆的。另外的一些學者認為，這種軸突神經傳導作用的改變能夠導至一些酶類如calpain和caspase-3的釋放，而這種改變進一步促進軸突細胞結構的破壞［6］，因此SBDPS也許能夠作為一種軸突損害程度的標志物。總之，腦組織中的SBDPS與創傷性腦損傷后有明顯的變化，隨著研究的不斷深入，SBDPS可能成為一種對創傷性腦損傷有臨床應用價值的標志物。

［1］Pineda JA，Lewis SB，Valadka，et al.Clinical significance of alphaII-spectrin break down products in cerebrospinal fluid after severe traumatic brain injury［J］.J Neurotrauma，2007，24（3）：354-366.

［2］Papa L，Robinson G，Oli M，et al.Use of biomarkers for diagnosis and management of traumatic brain injury［J］.Expert Opin Med Diagn，2008，28（7）：1-9.

［3］Papa L，Akinyi，Liu MC，et al.Ubiquitin C-terminal hydrolase is a novel biomarker in humans for severe traumatic brain injury ［J］.Crit Care Med，2009，38（12）：138-144.

［4］Farkas O，Polgar B，Szekeres-Bartho，et al.Spectrin break down products in the cerebrospinal fluid in severe head injury-preliminary observations［J］.Acta Neurochir Wien，2005，1 478（4）：855-861.

［5］McCracken E，Hunter AJ，Patel S，et al.Calpain activation and cytoskeletal protein break down in the corpus callosum of headinjured patients［J］.J Neurotrauma，1999，169（3）：749-761.

［6］Povlishock JT，Christman CWJ.The pathobiology of traumatically induced axonal injury in animals and humans：a review of current thoughts［J］.Neurotrauma，1995，124（9）：555-564.

（收稿2014-07-23）

R-332

B

1673-5110（2015）10-0068-02

隨機將70只成年雄性SD大鼠分為對照組（假手術組）10只，重型腦損傷組60只，于模型制作成功后處死小鼠，制備腦組織勻漿，所有標本均采用酶聯免疫吸附劑測定分析方法進行檢測SBDPS的濃度。結果 SBDP145和SBDP120濃度，在不同的時間點上實驗組明顯高于對照組，SBDP145在傷后6h就能夠檢測到明顯變化，而SBDP120直到到傷后72h才有明顯的升高。結論 創傷性腦損傷腦組織中的SBDPS與腦損傷的嚴重性有關。