2種組培方式草莓的擴繁效果及光合特性

柳燕　劉刃　竺錫武

摘要：比較分析固體培養基組織培養方式與生物反應器培養方式下草莓組培擴繁效果及其穴盤苗的光合特性。采用LC Pro+型便攜式光合系統測定2種組培方式獲得的組培穴盤苗的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（E）、葉胞間CO2濃度（Ci）。結果顯示，在個體生物量和種苗增殖系數方面，紅頰草莓快速擴繁采用生物反應器培養方式極顯著優于固體培養基組培方式；在光合速率、氣孔導度和呼吸效率方面，生物反應器培養方式的組培穴盤苗顯著優于固體培養基培養方式的組培穴盤苗；在胞間CO2濃度（Ci）方面，生物反應器培養方式的組培穴盤苗與固體培養基培養方式的組培穴盤苗差異不顯著。

關鍵詞：組培方式；草莓；組織培養；擴繁效果；光合特性

中圖分類號：S668.404 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0213-03

植物組織培養主要有利用固體培養基和液體培養基進行組織培養擴繁2種方式，其中利用固體培養基進行組織培養是傳統的組培方式，在草莓組織培養已有較多的研究[1-5]；利用液體培養基進行組織培養主要指采用生物反應器盛裝液體培養基通過瞬時浸沒外植體方式培養獲得植物組培苗（簡稱生物反應器培養或反應器培養），國外自20世紀80年代就已經開始發展[6-12]，而我國國內起步較晚[13-15]，生物反應器組培擴繁草莓苗方面的研究尚未見報道。固體培養基組織培養方式與生物反應器組織培養方式的比較在一些種類植物的外植體擴繁倍數、組培苗生長形態、鮮質量等方面都進行過研究[16-18]，但這2種組培方式培養的組培苗在光合特性方面有無差別國內外很少報道；而光合特性對組培苗的存活、壯苗有重要影響，已開始引起重視[19-20]。因此，本試驗開展了2種草莓組培方式組培擴繁效果與穴盤苗光合特性的比較研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅頰草莓植株由筆者所在的實驗室保存。

1.2 組培方法

（1）固體培養基組織培養法。按劉刃等的方法[5]進行。（2）生物反應器組織培養法。按開合式間歇浸沒植物生物反應器（浙江理工大學生物工程研究所，專利號為2010202088879.1）[13]操作進行。紅頰草莓的生物反應器培養主要參數設定：裝液量1 000 mL；浸沒頻率10 min/4 h；通氣量15 L/min；培養時間50 d；培養液更換頻率25 d/次；接種密度40個/L。

1.3 光合特性的測定

將通過2種培養方式得到的紅頰草莓組培苗經過穴盤（50孔穴盤，52 cm×26 cm）煉苗30 d后，移至日光溫室內對其功能葉片的光合速率進行測定。數據測量期間，2組組培穴盤苗均移至日光溫室，基質含水量維持在60%。光合測定條件：外界氣溫在18～25 ℃之間，分別取生物反應器培養和固體培養的紅頰草莓各5株，要求草莓組培穴盤苗具有8～10根葉柄、生長旺盛、3出復葉完全展開等特點。選定每株草莓第3張新生葉。

測量前將50孔組培穴盤苗移至室外，令其在自然光下適應1 h，以促使葉片氣孔打開，測量在隔日10：00開始進行。設定LC Pro+型便攜式光合系統（ADC，England）的測量條件為：光合有效輻射（PAR）800 μmol/（m2·s），CO2供給濃度（350±2） μmol/mol，葉室溫度（25±1） ℃，相對濕度（65±2）%。在此條件下對組培穴盤苗葉片的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（E）、胞間CO2濃度（Ci）進行測量。

1.4 數據統計分析

試驗數據采用Excel 2013、SPSS 19.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 2種組培方式下草莓組培擴繁結果比較

在2種組培方式下培養的組培苗平均鮮質量（g）和外植體增殖系數見表1，在生物反應器培養下的外植體增殖系數可達到6.98，比對照組固體培養法的增殖系數（6.03）高158%，且差異極顯著；生物反應器培養獲得的組培苗平均鮮質量為4.14 g，是對照組固體培養（2.31 g）的1.79倍，且差異極顯著，說明單位時間內相同數量的草莓外植體使用生物反應器培養可獲得更多的種苗數量，提高擴繁效率。從生物量和種苗增殖系數可以發現，紅頰草莓快速擴繁采用生物反應器培養方式極顯著優于固體培養基組培方式。

2.2 2種組培方式的組培穴盤苗凈光合速率

從圖1可以看出，在培養后1、3、5、7 d，生物反應器培養的組培穴盤苗的凈光合速率顯著高于傳統固體培養的組培穴盤苗；在培養后7、9 d，雖然兩者之間差異不顯著，但生物反應器培養的組培穴盤苗的凈光合速率仍高于傳統固體培養的組培穴盤苗。總體來說，2種組培方式得到的紅頰草莓苗的光合速率在移栽初期差異顯著，隨著在日光溫室中隨著培養時間的延長，兩者之間的差異有逐漸縮小的趨勢。

2.3 2 種組培方式下組培穴盤苗的氣孔導度

從圖2可以看出，通過間歇浸沒式生物反應器得到的草莓組培穴盤苗葉片在培養后1 d的氣孔導度為

0.441 mmol/（m2·s），傳統固體培養的苗的氣孔導度為0.362 mmol/（m2·s），兩者之間差異顯著。培養后1、3、5、7 d，生物反應器組培穴盤苗與傳統固體培養的組培穴盤苗的氣孔導度差異顯著；在培養后7 d，生物反應器的組培穴盤苗在氣孔導度上與傳統固體組培穴盤苗之間差異不顯著，但整個測量過程中生物反應器組培穴盤苗氣孔導度均高于傳統固體組培穴盤苗。

2.4 2種組培方式下組培穴盤苗的蒸騰速率

從圖3可以看出，在培養后1、3、5、7 d，生物反應器組培穴盤苗的蒸騰速率均高于傳統固體組培穴盤苗。2種組培穴盤苗的蒸騰速率差值在培養后5 d達到最大，生物反應器組培穴盤苗為5.771 mmol/（m2·s），傳統固體培養的組培穴盤苗為4.879 mmol/（m2·s）；在培養后1、3、5、7 d，生物反應器培養的組培穴盤苗與傳統固體培養的組培穴盤苗的蒸騰速率差異顯著；在培養后7 d，生物反應器培養的組培穴盤苗蒸騰速率與傳統固體培養的組培穴盤苗之間差異不顯著。endprint

2.5 2種組培方式下組培穴盤苗的胞間CO2濃度

從圖4可以看出，生物反應器培養的組培穴盤苗的胞間CO2濃度均低于傳統固體培養的組培穴盤苗，在培養后9 d時的差值最大，生物反應器組培穴盤苗的Ci值為313.9 μmol/mol，傳統固體組培穴盤苗的Ci值為323.3 μmol/mol。在培養后1、3、5、7、9 d，2種不同培養方式得到的組培穴盤苗差異均不顯著。

3 結論與討論

本研究比較分析了生物反應器培養方式與傳統固體培養方式下紅頰草莓組培擴繁效果及其穴盤苗的光合特性。結果發現，紅頰草莓組培擴繁采用生物反應器培養方式優于固體培養基培養方式。生物反應器組培擴繁效果優于固體培養基組培擴繁效果，在其他一些植物種類的組培研究中已有一些報道[13-15，17]。本研究結果證明，利用生物反應器組培擴繁草莓也是可行的，并具有顯著優勢。

筆者發現，在組培苗的光合性能方面，生物反應器培養的草莓組培穴盤苗優于傳統的固體培養的組培穴盤苗。生物反應器培養的組培穴盤苗的凈光合速率、氣孔導度和呼吸效率顯著優于固體培養基培養的組培穴盤苗。結果表明，組織培養方法影響了苗的光合特性。本研究結果與Zhao等的結果[14，19]是相似的，即在強力通風條件下的苗比對照苗有更大的凈光合速率。Zhao等發現，強力通風能增強葉綠素含量[14]。筆者認為，強力通風可能是生物反應器培養方法培養的苗有更大的光合速率的原因。生物反應器培養的組培穴盤苗的氣孔導度顯著大于固體培養基的組培穴盤苗的氣孔導度，這個結果與Zhao等的結果[14，21]是一致的。Majada等發現，葉中氣孔的功能在通風條件下被改進[21]；Zhao等發現，強力通風能增強氣孔密度[14]。生物反應器培養的組培穴盤苗呼吸效率顯著大于固體培養基培養的組培穴盤苗，這個結果還沒有被報道，有待進一步驗證。生物反應器培養的組培穴盤苗的胞間CO2濃度均低于傳統固體組培穴盤苗，但差異不顯著，可能是因為生物反應器中組培苗相對較多，密度明顯大于固體培養法組培瓶中組培苗密度。隨著組培穴盤苗在自然環境下生長時間延長，2種培養方式得到的組培穴盤苗在凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率3個方面呈現出差異縮小的趨勢，這可能與組培穴盤苗逐步適應自然環境條件有關。生物反應器培養的草莓穴盤苗在初期具有更好的凈光合特性，能夠更加快速地適應外部環境，從而增加穴盤苗幼苗期的存活率，更高的凈光合速率也意味著更高的壯苗率，因此在商業化生產上具有較明顯的優勢。

參考文獻：

[1]覃蘭英，徐光霞，鄧世秀.草莓莖尖離體培養大量繁殖研究初報[J]. 中國果樹，1981（3）：38-40.

[2]郭亞華，于志明，鄧立平，等. 草莓組織培養研究初報[J]. 生物技術，1991，1（3）：30-32.

[3]羅君琴，李 麗，林 俊，等. “紅頰”草莓莖尖快繁技術研究[J]. 現代園藝，2008（11）：4-5.

[4]孫永平，高年春，張 瓊，等. 紅頰草莓組培快繁技術研究[J]. 江蘇農業科學，2011，39（5）：63-64.

[5]劉 刃，呂 樂，竺錫武.紅頰草莓組培標準化及穴盤壯苗研究[J]. 江蘇農業科學，2013，41（7）：34-37.

[6]Tisserat B，Vandercook C E. Development of an automated plant culture system[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1985，5（2）：107-117.

[7]Simonton W，Robacker C，Krueger S. A programmable micropropagation apparatus using cycled liquid medium[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1991，27（2）：211-218.

[8]Lorenzo J C，González B L，Escalona M，et al. Sugarcane shoot formation in an improved temporary immersion system[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1998，54（3）：197-200.

[9]Alister B，Finnie J，Watt M P，et al. Use of the temporary immersion bioreactor system （RITA） for production of commercial Eucalyptus clones in Mondi Forests （SA）[J]. Liquid Culture Systems forin vitro Plant Propagation，2005，4：425-442.

[10]Berthouly M，Etienne H. Temporary immersion system：a new concept for use liquid medium in mass propagation[J]. Liquid Culture Systems for in vitro Plant Propagation，2005，2：165-195.

[11]Hempfling T，Preil W. Application of a temporary immersion system in mass propagation of Phalaenopsis[J]. Liquid Culture Systems for in vitro Plant Propagation，2005，2：231-242.endprint

[12]Roels S，Escalona M，Cejas I，et al. Optimization of plantain （Musa AAB） micropropagation by temporary immersion system[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2005，82（1）：57-66.

[13]陳集雙，張本厚，賈明良，等. 間歇浸沒的開合式植物生物反應器：中國，2010202088879.1[P]. 2011-04-27.

[14]Zhao Y，Sun W，Wang Y，et al. Improved mass multiplication of Rhodiola crenulata shoots using temporary immersion bioreactor with forced ventilation[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，166（6）：1480-1490.

[15]趙望鋒，王力華.間歇浸沒式生物反應器在大規模組織培養中的應用研究[J]. 安徽農業科學，2007，35（2）：317-320，323.

[16]Maene L，Debergh P. Liquid medium additions to established tissue cultures to improve elongation and rooting in vivo[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1985，5（1）：23-33.

[17]賈明良.三葉半夏[Pinellia ternata （Thunb.） Breit.]組培標準化研究及生物反應器擴繁[D]. 杭州：浙江理工大學，2010.

[18]畢瑞明.不同培養方法對甘薯無菌苗生長的影響[J]. 生物技術，2002，12（2）：26-28.

[19]月 德，Desjardins Y，Gosselin A.草莓組培苗的光合能力與強制通氣對其生長的影響[J]. 園藝學報，1993，20（2）：123-126.

[20]王必尊，唐粉玲，何應對，等. 不同基質對香蕉組培苗生長及光合特性的影響[J]. 熱帶作物學報，2013，34（3）：398-402.

[21]Majada J P，Centeno M L，Feito I，et al. Stomatal and cuticular traits on carnation tissue culture under different ventilation conditions[J]. Plant Growth Regulation，1998，25（2）：113-121.楊燕林，王朝文，楊洪濤，等. 不同土壤條件對藍莓生長的影響[J]. 江蘇農業科學，2015，43（10）：216-217.endprint