可誘導共刺激分子配體上調Graves病動物免疫應答

余毅愷　馮業晨　張木勛　葉　叢　涂　巍(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院風濕免疫科，武漢430030)

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可誘導共刺激分子配體上調Graves病動物免疫應答

余毅愷馮業晨張木勛葉叢涂巍
(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院風濕免疫科，武漢430030)

［摘要］目的:研究可誘導共刺激分子及配體(ICOS/ICOSL)在Graves病(以下簡稱甲亢，GD)中的病理生理機制。方法: 45只遠交系BALB/c小鼠隨機分成三組各15只，用基因槍將不同質粒注射。A組采用表達pCDNA3.0-mICOSL和pCDNA3.0-hTSHR的質粒免疫; B組用表達pCDNA3.0-hTSHR的質粒免疫，C組采用空質粒pcDNA3.0免疫作為對照組。放免法測定小鼠血清游離甲狀腺素(FT4)、脾臟細胞上清液IFN-γ度，ELISA法血清促甲狀腺素受體抗體(TRAb)，小鼠血清和轉染人hTSHR－CHO細胞共同孵育后檢測cAMP濃度判斷TRAb自身抗體活性。結果:質粒注射后A組小鼠血清FT4水平(0.49± 0.25) pg/ml高于C組(q= 6.571，P=0.023) ;成模達標率(10/15例)高于B、C兩組(χ2= 14.47，P= 0.005)。A組小鼠脾臟原代培養上清液IFN-γ的產量(1.88±0.41) pmol/L明顯高于B、C兩組(F= 17.85，P= 0.003)。A組小鼠血清TRAb活性188.3 (179.7～260.2) %高于B、C組(P= 0.027)。結論:外源性導入pCDNA3.0-mICOSL到GD小鼠，能刺激其脾臟淋巴細胞分泌IFN-γ，增加自身抗體TRAb活性，從而上調GD動物體內免疫應答。

［關鍵詞］ICOSL; Graves病; TSHR抗體;基因槍

①本文為2012年武漢科技局青年晨光計劃資助項目(No.201 271031432)。

ICOSL could upregulate immune response in Graves's disease animal models

YU Yi-Kai，FENG Ye-Chen，ZHANG Mu-Xun，YE Cong，TU Wei.Department of Rheumatology and Immunology Tongji Hospital，Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

［Abstract］Objective: To study the pathological mechanism of the inducible co-stimulator molecular and ligand (ICOS/ ICOSL) in Graves disease animal.Methods: 45 out-bred BALB/c mice were randomly divided into three groups with 15 rats in each group; using gene gun to deliver different plasmid injection.Group A was delivered with pCDNA3.0-mICOSL and pCDNA3.0-hTSHR，Group B with pCDNA3.0-hTSHR and null pCDNA3.0 with Group C for immunization as the control group.The concentration of serum free thyroxine immunization was deter mined with immunoassay and serum thyrotropin receptor antibody (TRAb) with ELISA，supernatant of IFN-γ concentration in mouse spleen cells was measured with radioimmunoassay，and hTSHR transected CHO cells were incubated to detect the concentration of cAMP to deter mine autoantibody TRAb activity.Results: After plasmid injection serum FT4 level in Group A (0.49±0.25) pg/ml (q= 6.571，P=0.023) was higher than that in Group C，the standard rate was higher than Group B and C (χ2= 14.47，P = 0.005) .IFN-γ concentration of mice spleen cultured supernatant in Group A (1.88±0.41) pmol/L was significantly higher than the other two groups.The activity of autoantibody TRAb in Group A 188.3 (179.7-260.2) % was higher than that in the other two groups(P=0.027) .Conclusion: Exogenous delivery of pCDNA3.0-mICOSL plasmid in GD mice could stimulate the spleen lymphocytes to secrete more IFN-γ，increase the activity of TRAb autoantibodies and might lead to upregulation of immune response in Graves animal model in vivo.

［Key words］ICOSL; Graves disease; TSHR autoantibody; Gene gun

GD是一種伴有甲狀腺激素增高的自身免疫性疾病，發病機制為甲狀腺細胞表面促甲狀腺素受體(TSHR)部分脫落被外周血APC(抗原呈遞細胞)攝取，降解為短肽和MHCⅡ分子結合于APC表面，形成第一信號(MHC-Ag肽信號)由TCR識別。共刺激分子和APC表面受體結合，形成第二信號［1］。經過上述“雙信號和雙識別”激活后，特異性T細胞活化并導致B細胞激活，產生促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)和TSHR結合，導致甲狀腺激素水平增高和相應臨床癥狀。新近發現一種屬于B7分子超家族的可誘導共刺激分子(ICOS)，其配體(ICOSL)表達在APC表面呈可誘導性。ICOS僅在活化和記憶性T細胞上表達和自身免疫性疾病關系密切。Yoshinaga［2］報道ICOSL-Fc過度表達的轉基因小鼠可表現為人類Crohn病和高球蛋白血癥的臨床綜合征。Hamel等［3］發現在ICOSL(-/-)的BALB/c模型小鼠，使用免疫佐劑誘導的類風濕關節炎癥明顯減輕。Her［4］報道在系統性紅斑狼瘡患者外周單核細胞ICOSL表達明顯增高且和狼瘡活動SLEDAI評分呈正相關。近來研究發現GD患者甲狀腺組織ICOSL表達也明顯增高［5，6］。

本研究分別用表達hTSHR和mICOSL的質粒免疫小鼠，檢測自身抗體和脾臟細胞因子水平，試圖評價增加ICOSL表達對GD動物免疫應答過程的影響。

1　材料與方法

1.1動物分組和造模4～6周遠交系幼年雌性BALB/c鼠共45只購自華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心［SCXK(鄂) 2004-0007］。按照體重依次給每個動物編號，采用隨機數字法分成3組每組15只: (1) ICOSL組(A組)同時注射pcDNA3.0-hTSHR和pcDNA3.0-mICOSL質粒; (2) TSHR組(B 組)注射pcDNA3.0-hTSHR質粒; (3) CLT組(C組)注射質粒pcDNA3.0作為空白對照。前期預試驗發現，小鼠頻繁取血后血清白蛋白可明顯下降導致甲狀腺素結合率降低影響血清FT4檢測，故CTL組15只小鼠基線期即采血測定血清FT4。

1.2方法

1.2.1大量擴增制備質粒并制造基因槍子彈上述質粒大量擴增后，運用Tiangene公司質粒大提試劑盒提取并純化。XbaⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后測定純度和濃度。其中金顆粒和Helios基因槍購自Biorad公司Biolistic PDS-1000/He，驅動類型高壓氦氣。包被DNA微粒制作具體步驟見參考文獻。后腹部皮膚備皮后注射，劑量為10 μg質粒DNA/次/小鼠/子彈，基因槍壓力為400 psi。

1.2.2測定小鼠血清FT4免疫動物后第2周肝素抗凝處理的毛細玻管于小鼠內眥靜脈取全血。放射免疫法測定FT4，于核醫學科采用DFM-96型10管放射免疫γ計數儀測定。血清室溫放置后離心(15 min 3 500 r/min)，棄上清液測定各管沉淀的放射性計數cpm。以S0(cpm數)為B0，各標準管(cpm數)為Bi，求各管的百分結合率(Bi/B0)。計算各標準點的結果在半對數坐標紙上，以標準品濃度為橫坐標，以Bi/B0為縱坐標，繪制Bi/B0－Log圖，從標準曲線上查出未知樣品濃度，超過C組小鼠FT4均數+3倍標準差確認為甲亢造模成功［7］。

1.2.3測定小鼠脾臟勻漿液IFN-γ質粒免疫2周后將小鼠脾臟組織剪成1 mm3左右小塊。分離后的脾臟原代細胞放置于24孔培養板中培養。培養條件為RPMI1640培養基+10%熱滅活胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，1 mmol/L丙酮酸鈉，50 μg/ml慶大霉素，50 μmmol/L β-硫氫基乙醇和100 U/ml青霉素。給予5 μg/ml刀豆素A(ConA IV Sigma公司，批號C2010，作為有絲分裂原可以刺激T淋巴細胞的增殖)和TSHR抗原(0.2 mU/ml)共同培養72 h后取培養上清液，5 000 r/min的速度下離心去除細胞沉渣。放射免疫法測定IFN-γ濃度。

1.2.4測定小鼠血清TRAb抗體滴度ELISA試劑盒購自德國EuroImmune公司(批號03051986 190)由我院內分泌實驗室專職人員完成。試驗步驟概括如下，以濃度為0～40 U/I的標準血清IgG為定標品，酶標儀于450nm測定樣品吸光值，樣本血清待測品TRAb濃度A(%) = (1－樣品吸光值/陰性對照吸光值)×100，其中每個定標品樣本均設復孔。A＞25%判斷抗體為陽性。

1.2.5測定小鼠血清TRAb抗體活性將轉染hTSH的中國倉鼠卵巢細胞(以下簡稱hTSH-CHO)和小鼠血清共同培養72 h候收集上清，放免法測定cAMP濃度。試劑盒購至北京東亞醫學研究所，于核醫學科采用DFM-96型10管放射免疫γ計數儀測定。測定hTSHR-CHO細胞分泌上清液中cAMP濃度較正常對照血清的增幅來判斷抗體的活性。計算公式= (實驗cAMP濃度－對照cAMP濃度) /對照cAMP濃度×100%。

1.3統計學處理所有計量數據資料經正態分布和方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間有無顯著性差異，隨后兩兩樣本均數間的比較采用Newman-Kelus分析。Kruskal-Wallis秩和檢驗比較非正態分布數據組有無間顯著性差異，隨后兩兩比較采用Dunn's多重檢驗。TRAb陽性率比較采用行×列表的卡方檢驗，如有統計學意義再行分割進行兩兩比較。P＜0.05定義為統計顯著性水準。所有統計分析采用SAS8.0軟件。

2　結果

2.1小鼠血清FT4水平質粒注射后三組小鼠血清FT4濃度有差異(F=12.03，P=0.011)，Newman-Keuls多重檢驗進行組間兩兩比較，ICOSL組(0.49±0.25) pg/ml和TSHR組(0.43±0.17) pg/ml明顯高于CTL組(0.18±0.08) pg/ml(q= 6.571，P= 0.023; q= 5.211，P=0.034)。但是ICOSL和TSHR兩組無顯著性差異(q = 1.359，P = 0.460)。根據參考文獻［7］GD動物造模成功標準為血清FT4濃度超過0.42 pg/ml (即CTL值+3倍標準差=0.18+0.08 ×3)，ICOSL組和TSHR組達標分別10例和6例而CTL組為0。行×列表χ2檢驗顯示ICOSL組高于其他兩組(χ2=14.47，P=0.005)，見圖1。

2.2小鼠脾臟IFN-γ產量ANONA顯示小鼠免疫2周后，脾臟細胞原代培養上清液IFN-γ濃度(F = 17.85，P=0.003)。D'Agostino＆Pearson正態分布檢驗，IFN-γ呈正態分布ANOVA進行均數的組間比較。Newman-Kelus兩兩比較顯示，ICOSL組濃度為(1.88 ±0.41) pmol/L明顯高于TSHR組(1.54±0.28) pmol/ L(q=3.972，P=0.041)和CTL組(1.13±0.31) pmol/L (q=8.446，P=0.012)。見圖2。

淚水盈滿了我的雙眸，這世界上最痛苦的事，莫過于知道了結局，卻無法改變。我只有眺望遠方，看看這江南最后的繁華。

圖1　三組小鼠血清FT4水平比較Fig．1 Comparison of serum FT4 among three groups

圖2　質粒免疫后脾臟組織勻漿IFN-γ濃度Fig．2 IFN-γ concentration of spleen homogenate after plasmid immunization

2.3小鼠自身抗體TRAb陽性率和活性比較ELISA法檢測ICOSL和TSHR兩組TRAb陽性例數分別為11和4，CTL組為0。Fiseher精確概率法顯示ICOSL組陽性率高于TSHR組但無統計學差異(χ2=3.394，P=0.065)。

質粒免疫2周后取小鼠血清和hTSHR-CHO細胞培養后測定分泌上清液中cAMP濃度計算TRAb活性。Dunn's多重檢驗進行兩兩比較ICOSL組TRAb活性188.3(179.7，260.2) %明顯高于TSHR 組162.2(60.7，170.5) %和CTL組88.6［(66.1，87.9) %，P=0.027］，見圖3。

Note: The horizontal ordinate represents different groups and the longitudinal ordinate represents relative activity of serum auto-antibody TRAb.* .P＜0.05.

3　討論

Wang等［5］利用11C4、12B11和MIH12三種針對不同表位的ICOSL單抗進行組織學和流式細胞學檢測時，發現在甲功正常和腺瘤患者甲狀腺組織ICOSL表達極低，而在GD患者ICOSL表達明顯增高。動物實驗證實，ICOS/ICOSL系統過度活化可以導致免疫應答和自身抗體產生異常增強。抑制T細胞和APC之間的共刺激分子信號通路，能抑制GD小鼠體內免疫應答過程［8］。

本課題組在隨訪96例GD患者時發現，共刺激分子CD80 mRNA高表達和TRAb抗體持續陽性，都是GD預后不良危險因素(P = 0.034，OR = 3.089)。Logistic回歸分析顯示:影響GD預后的諸多危險因素中，CD80高表達僅次于TRAb，相關性高達0.79。

基因槍將外源基因，擊中并高速穿透真空室中受體細胞膜，將吸附于微彈上的外源DNA導細胞導入機體，被惰性金屬金顆粒包裹，緩慢釋放獲得整合與表達。在GD動物模型制備中，質粒DNA非外源蛋白質或減毒活疫苗注入，極少引起超敏反應(無一例動物注射質粒后死亡)，可被皮下APC細胞攝?。?，10］。ICOSL表達質粒的加入能增加抗原呈遞中“MHC-多肽雙信號-雙識別”的作用。

伍麗萍報道造模后GD小鼠50% TRAb水平增高，21.4%血清TT4增高且TT4增高的小鼠有不同程度的體重降低。我們已成功利用TSHR質粒誘導GD動物模型［11］，本研究進一步發現增加GD小鼠ICOSL表達，2周后血清FT4為(0.49±0.25) pg/ml高于CTL組(0.18±0.08) pg/ml。雖然較TSHR組(0.43±0.17) pg/ml無顯著性差異，但ICOSL組血清FT4水平超過CTL組3倍標準差例數為10例，明顯高于TSHR組6例。

IFN-γ是一種促炎因子在自身免疫性疾病中起重要作用。Minelli［10］報道慢性丙型病毒性肝炎患者運用人重組干擾素治療時，包括甲亢等多種自身免疫性甲狀腺疾病發病率增高。ICOSL組小鼠脾臟細胞受到TSHR抗原刺激，上清液分泌INF-γ(1.88± 0.41) pmol/L明顯高于TSHR組(1.54±0.28) pmol/ L和CTL組(1.13±0.31) pmol/L，說明在增加GD小鼠ICOSL表達后，能增強體內免疫應答過程。

未經治療的GD患者TRAb陽性可高達91.7%，是臨床評價疾病預后指標之［12］。雖然ICOSL和TSHR組的小鼠TRAb陽性率無顯著性差異，但ICOSL組TRAb抗體活性188.3 (179.7，260.2) %明顯高于CTL組88.6(66.1，87.9) %和TSHR組162.2(60.7，170.5) %。

質粒導入增加外源性ICOSL表達，增強GD小鼠免疫應答，表現TRAb自身抗體活性增高和脾臟分泌IFN-γ增多。若能阻斷ICOS/ICOSL交聯產生的共刺激信號，能否為治療自身免疫性疾病特別是GD提供新的藥物靶點，值得深入研究。本研究不足之處在于，未進一步觀察Anti-ICOSL抗體注射后小鼠免疫應答下調的影響。由于Anti-ICOSL抗體價格昂貴，僅在預實驗中應用了Anti-ICOSL(Protein Group Inc，Cat: 14922-1-AP，24 μg/150 ml)部分小鼠出現超敏反應導致死亡，故抗體種類和注射時機的選擇還需要進一步摸索。

致謝:質粒pCDNA3.0-mICOSL和pCDNA3.0-hTSHR日本長歧大學Nagayama教授提供。

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［收稿2015-04-20修回2015-06-01］

(編輯許四平)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．005

作者簡介:余毅愷(1980年－)，男，醫學博士，主治醫師，主要從事自身免疫性疾病的研究。

文章編號1000-484X(2015) 10-1320-04

文獻標志碼A

中圖分類號R392